用于乙型肝炎疫苗生产的重组汉逊酵母工程菌(由华兰生物公司提供)含有游离质粒，可在宿主细胞中独立复制并表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。目前在生产中，为了从基因水平监控抗原表达量，对发酵细胞进行了整合基因保有率的检测。但该方法只能测定细胞中有无目的基因，不能对目的基因进行定量。由于细胞内整合目的基因拷贝数的多少直接影响最终的HBsAg的表达量，所以生产中有必要对整合的目的基因拷贝数进行实时定量检测。测定目的基因拷贝数的方法有很多，如氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法、高效液相色谱法、核酸杂交方法等等，但他们都有各自的缺点，有的准确性不高，有的耗时长不适于实时检测。所以建立一种快速准确的方法对重组汉逊酵母目的基因拷贝数的检测进行检测是十分有必要的。本文主要从以下几个方面进行概述和研究： 1、主要概述了重组乙肝疫苗的分子结构以及研究进展。简要介绍质粒构建和工程汉逊酵母菌。对检测重组基因拷贝数的常用几种方法进行简单概述与比较，尤其对荧光定量PCR法的反应原理、方法及应用进行系统综述，最后论述了荧光定量PCR法检测重组汉逊酵母中HBsAg基因的拷贝数的应用。 2、比对重组质粒表达载体和汉逊酵母全基因序列，找出重组质粒表达载体上独有的序列，设计其引物；另外设计乙肝表面抗原基因引物。之后提取重组汉逊酵母基因组DNA，分别使用上述两对引物进行PCR，独有序列无PCR产物则证明无游离质粒载体存在，同时乙肝表面抗原基因序列有PCR产物则证明有目的基因存在，这两个结果共同支持目的基因的状态是整合于酵母染色体上的。 3、重组汉逊酵母基因中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和检测传代稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为研究和分析重组基因的重要内容。利用快速、灵敏的荧光定量PCR法检测外源基因(HBsAg)拷贝数，以Mox基因为内源参照基因。通过梯度稀释法，建立了Mox基因和HBsAg基因的循环数(Ct值)与起始模板数的相关标准曲线，其相关系数分别达到0.9996和0.9982。通过目的基因HBsAg和内源参照基因Mox在同一荧光强度下出峰的循环数比较，获得了目的基因HBsAg在重组汉逊酵母中的拷贝数为39个拷贝。此种方法优于传统的DNA杂交法检测重组汉逊酵母HBsAg基因的拷贝数，比传统的斑点杂交法快速准确。 4、通过对发酵前重组汉逊酵母菌种整合的目的HBsAg基因拷贝数和进行生产发酵后的发酵液中汉逊酵母菌种整合的目的HBsAg基因拷贝数测定，得到了发酵前目的HBsAg基因在重组汉逊酵母基因组中的拷贝数为38，发酵后目的HBsAg基因在重组汉逊酵母基因组中的拷贝数为35，则发酵前后基因拷贝数相差-7.9％。分别取了两批发酵液测定HBsAg基因在重组汉逊酵母中拷贝数的变化分别为-1.3％和6.2％。由此可见发酵前后HBsAg基因在重组汉逊酵母中是稳定存在的。取不同规模和批次发酵液测定可知拷贝数相差很小，即放大发酵规模质粒拷贝数还能稳定存在于细胞内。