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PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶,保护细胞压力应激所导致的线粒体功能障碍,调控神经元分化。突变的PINK1(PARK6)导致常染色体隐性遗传早发性帕金森病(PD)。β-synuclein(β-syn)是α-syn同系物,其错义突变β-syn P123H被发现存在于家族性路易体痴呆患者。突变蛋白β-syn P123H在细胞内形成嗜酸性包涵体,并且与LAMP-2,ATP13A2,cathepsin等溶酶体标志物共存,在胞浆聚集诱导细胞凋亡,具有加速神经退化的毒性作用。PINK1能够维持线粒体内稳态,在PD病理学变化过程起着关键作用,但是PINK1通过线粒体保护作用介导突触核蛋白病理学过程的机制还不清楚。本课题将在稳定表达Parkin的He La细胞及稳定表达β-syn P123H的B103神经母细胞瘤细胞进行,研究PINK1/Parkin通过调控线粒体自噬,促进β-syn P123H自噬降解的神经保护作用及其分子机制。本文采用PCR构建PINK1野生型(PINK1 WT)及两步PCR法定点突变技术构建PINK1 Q126P、E240K、G309D、L347P、P498L突变真核表达载体,测序验证后应用免疫印迹技术(Western Blot)鉴定其在细胞内表达情况。WST-1细胞活性检测及LDH细胞毒性实验分析PINK1 WT及突变体对细胞存活的影响。结果显示,转染PINK1突变体的细胞存活率下降,细胞毒性增加。相比对照组,转染野生型PINK1质粒的细胞无显著性差异。应用细胞免疫荧光化学染色的方法,观察PINK1 WT及其突变体细胞定位情况,以及Parkin突变体T240R、R275W的细胞分布形态。运用线粒体TMRE荧光标记技术,以FCCP组作为阳性对照,分析Parkin突变体T240R、R275W对线粒体膜电位的影响。通过脂质体转染及Western Blot方法,分析PINK1、Parkin对线粒体分裂融合动态变化的影响。免疫荧光细胞化学结果显示:PINK1突变后线粒体异常聚集。Parkin突变体在胞浆形成聚集体,并且导致线粒体膜电位降低。免疫印迹分析结果显示:PINK1、Parkin的突变则导致了线粒体分裂、融合功能降低。野生型PINK1、Parkin参与线粒体质量控制,促进β-syn P123H自噬降解。免疫荧光细胞化学实验证明β-syn P123H及Parkin T240R聚集体经自噬溶酶体途径降解,Parkin T240R则加重了β-syn P123H聚集体的形成。通过自噬诱导剂Rapamycin,抑制剂3-MA、NH4Cl作用,结合TUNEL细胞凋亡检测方法,研究自噬在β-syn P123H、Parkin T240R所诱导的细胞凋亡过程的作用。对TUNEL阳性细胞进行计数,统计分析结果显示:相对于DMSO组,3-MA、NH4Cl组细胞死亡数目明显增多,而Rapamycin组细胞死亡数目减少。总之,突变PINK1诱导线粒体断裂形成聚集体,并且导致细胞活性下降,细胞毒性增加。Parkin突变体在细胞内形成聚集体,导致线粒体膜电位降低。Parkin突变聚集体和β-syn P123H经自噬溶酶体途径降解,并且Parkin突变体加重了β-syn P123H聚集体的形成。野生型PINK1、Parkin参与线粒体质量控制,促进β-syn P123H自噬降解。在β-syn P123H诱导的突触核蛋白病理学过程中,线粒体相关蛋白PINK1/Parkin介导线粒体自噬及分裂、融合过程发挥保护作用。