论文部分内容阅读
黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种重要的野生豆科牧草,具有较强的抗寒、抗旱、耐贫瘠的特点,是研究植物抗冷机制的良好材料,由于它能够与紫花苜蓿杂交,因此已成为苜蓿育成品种最重要的抗性基因源。本文通过动态表达分析验证筛选出一些黄花苜蓿和紫花苜蓿冷诱导下表达有差异的基因,并通过冷处理黄花苜蓿中DREB基因进行验证。本实验得到脱水性响应元件结合蛋白(Dehydration-responsive element-binding,DREB)基因的主体片段,克隆出该基因编码区全长。通过半定量RT-PCR分析该基因在温度胁迫、盐胁迫、脱水胁迫和ABA处理条件下的表达规律,同时还探讨了该基因在紫花苜蓿,截形苜蓿中的同源基因在低温下的表达规律。本研究中还构建了pBI-MfDREB超表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,筛选出42株阳性转基因植株。主要研究结果如下:
1.低温诱导下冷相关基因的表达分析
通过基因动态表达分析的方式筛选出黄花苜蓿和紫花苜蓿冷诱导下有差异的基因,分别为ABC1 family protein-like、putative serine/threonine protein kinase、Ribosomal protein S5、nitrate transporter、putative 60S acidic ribosomal protein、M.t clone mth3-53o24、M.t chromosome8 clone mth2-75a15、M.t MTH2-72111 on chromosome 3、M.t chromosome 5 clone mth3-83i12,并对全部基因进行了分析。
2.黄花苜蓿MfDREB基因的克隆
利用NCBI数据库中同源基因序列设计PCR引物,从冷处理黄花苜蓿叶片cDNA中,通过RT-PCR.扩增得到的黄花苜蓿MfDREB基因。MfDREB全长1584bp,GenBank登记号:ES323190,开放阅读框1026bp,编码342个氨基酸的蛋白。利用生物信息学的方法,对该基因的结构和蛋白的多重序列比对及同源性分析。MfDREB编码342个氨基酸的蛋白,分子量为37905.5D,理论等电点6.34。氨基酸序列与GmDREB编码的序列同源性最高,达到95％,在氨基酸150-210之间存在一个保守核心结构域AP2位点,进一步的生物信息学分析发现MfDREB属于AP2/EREBP转录因子家族DREB亚家族中DREB2类的转录因子。
3.黄花苜蓿MfDREB基因的表达分析
半定量RT-PCR的结果表明,MfDREB在低温、盐和脱水胁迫下其表达量会迅速上调,表明该基因与黄花苜蓿的抗寒、抗盐和抗旱密切相关。外源ABA对MfDREB的表达影响较为强烈,表明MfDREB的表达受ABA信号转导系统控制。在紫花苜蓿中,DREB的同源基因也会受冷诱导表达,但表达的上调强度不及黄花苜蓿强。
4.黄花苜蓿MfDREB基因转化烟草分析
构建了pBI-MfDREB超表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,转基因植株经过PCR检测,筛选出58株PCR阳性植株,挑选16株转MfDREB烟草进行Southern杂交分析,结果表明这些转化植株来自不同的转化事件。