骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，在特定条件下可以向成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成肌细胞等多种细胞分化，是组织工程研究中常用的种子细胞。迄今为止，触发和控制BMSCs向成骨细胞方向分化的基因机制仍未明嘹。本研究目的在于建立大鼠BMSCs的分离、纯化、培养及体外骨向分化诱导体系，应用基因芯片技术筛选BMSCs向成骨细胞方向分化的差异表达基因，并采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RQ-PCR）技术在细胞学水平上定量检测筛选出的基因在BMSCs骨向分化过程中表达量的变化，分析其变化趋势，为深入了解BMSCs骨向分化的分子调控机制和功能学研究奠定基础。本研究采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化BMSCs，进行原代培养，当贴壁细胞铺满培养瓶底约80％时传代，将第三代的BMSCs加入骨向诱导液行骨向诱导，通过观察细胞形态、描绘细胞生长曲线、计算细胞倍增时间、定量检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、茜素红矿化结节染色等对未诱导和骨向诱导的骨髓间充质干细胞的生物学特性进行研究。在上述实验的基础上，在相同的培养条件下，取第三代的BMSCs行骨向诱导，骨向诱导后14天的细胞作为实验组，未诱导的0天细胞作为对照组，提取0天和骨向诱导后14天的细胞的RNA，应用基因芯片技术筛选BMSCs向成骨细胞方向分化的差异表达基因。在相同条件下，同样取第三代的BMSCs，将行骨向诱导的BMSCs作为实验组，未诱导的0天细胞作为对照组，分别提取O天和骨向诱导后4天、1周、2周和3周5个不同时相细胞的RNA，对细胞的总RNA质量和RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）产物等进行质控分析，采用实时荧光定量PCR技术对筛选出的差异表达基因在BMSCs骨向分化过程中的表达量变化进行连续性研究，分析其变化趋势，并利用生物信息学方法对其与成骨相关的功能进行初步探讨。研究结果显示采用的密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的BMSCs，用含β-甘油磷酸钠、地塞米松、左旋抗坏血酸和维生素D3的骨向诱导液对第三代的BMSCs进行诱导培养，成功诱导BMSCs骨向分化。经检测发现，诱导培养基和原代培养基对细胞生长的影响无明显差异，原代培养基培养的BMSCs的倍增时间为30小时，骨向诱导后其倍增时间为40小时；BMSCs经过骨向诱导后，形态学上表现出典型的成骨细胞改变；加入诱导液培养的BMSCs碱性磷酸酶活性明显增加，而未诱导细胞的碱性磷酸酶活性仍保持较低水平，无明显变化；骨向诱导1周后，细胞Ⅰ型胶原免疫化学染色呈阳性反应；BMSCs经骨向诱导后2周可见明显的矿化结节形成，茜素红染色表现为细胞间片状红染的类圆形的致密不透光团块。应用基因芯片技术成功筛选出BMSCs向成骨细胞方向分化的差异表达基因浦肯野细胞蛋白4（Purkinje cell protein 4，Pcp4）基因。实时荧光定量PCR结果表明，在BMSCs向成骨细胞分化过程的5个时段，Pcp4基因的表达量呈上升趋势，其中Pcp4基因在第7天时的表达量比第0天的对照组升高了7倍，在第14天时的表达量比第0天的对照组升高了9倍，在第21天时的表达量比第0天的对照组升高了6倍，其表达量的峰值在第14天，与应用基因芯片技术的检测结果完全符合，说明在BMSCs向成骨细胞分化的过程中，Pcp4为上调表达基因。通过结合生物信息学方法分析，我们作出了如下推测：矿化结节的形成是成骨能力的可靠指标，Pcp4有调节Ca²⁺结合动力学的能力，可能参与促进钙盐的沉积、形成矿化结节；在BMSCs骨向分化的过程中，蛋白激酶路径的激活是BMPs活化信号的关键，而Pcp4与CaM依赖性蛋白激酶的激活有关，参与了PKA的调控，而且Pcp4有突触传递功能，因此认为Pcp4可能与BMPs之间存在某种信号传导关系。Pcp4基因与成骨有关的具体功能值得深入研究。综上所述，本研究采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs，获得了高纯度的BMSCs，采用骨向诱导液成功诱导BMSCs成骨定向分化。应用基因芯片技术首次成功筛选出BMSCs向成骨细胞方向分化的差异表达基因Pcp4基因。采用实时荧光定量PCR技术，对应用基因芯片技术筛选出的BMSCs骨向分化过程中的差异表达基因Pcp4在不同时相的表达量进行连续性研究，结果表明在BMSCs向成骨细胞分化的5个时段，Pcp4基因的表达量呈上升趋势，其表达量的峰值在第14天。表明Pcp4基因介导了BMSCs的骨向分化过程，是BMSCs骨向分化的上调表达基因，为进一步进行Pcp4基因与成骨有关的功能学研究奠定了基础。