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研究背景及目的肾癌,即肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),是常见的泌尿系统恶性肿瘤,占成人全身恶性肿瘤的4%,分别位列男性和女性恶性肿瘤中第6和第8位。超过16%的患者初诊时已发生转移,其中以肺转移和骨转移最为常见。转移性肾癌预后极差,5年生存率在12%以下。近年来,sg RNA(单引导RNA)引导的CRISPR/Cas9(簇状规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)已经成为研究基因组的强大工具。CRISPR/Cas9的可编辑性使其在高通量探测基因组方面特别有利。简易有效的sg RNA文库合成使CRISPR/Cas9筛选能够快速用于研究基因组、转录和表观基因组改变后的功能变化。而体内的全基因组筛选能尽量的模拟肿瘤组织发生转移的病理过程,找出在该过程中发挥重要作用的相关基因。SDHD(琥珀酸脱氢酶复合体亚基D)是一种抑癌基因,其表达产物SDHD是三羧酸循环中代谢相关酶,在各组织中广泛表达。有研究表明SDHD与VHL综合征等家族性肾癌发生的病理过程相关,但其在肾癌转移过程中的功能尚不明确。我们的研究将为肾癌的增殖和肺部转移的形成提供新的理论依据,为肾癌治疗寻找新的潜在的基因靶点。研究方法1、通过扩增人类全基因组敲除文库质粒、制备慢病毒文库、摸索筛选条件、文库细胞系建立等过程,建立体外全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞池模型;2、通过异种细胞移植免疫缺陷鼠建立CRISPR/Cas9肾癌肺转移动物筛选模型,观察成瘤情况,收集组织标本,进行高通量测序;3、利用MAGeCK(RRA)等生物信息学分析方法,对测序数据进行质控并分析,结合体外细胞系转录组测序数据及TCGA、GEO等生物信息数据库数据,筛选肾癌肺转移潜在关键基因;4、利用CRISPR/Cas9敲除、慢病毒转染等方法,进行如平板克隆、细胞增殖、细胞划痕、transwell等功能实验,并在小鼠体内进行成瘤实验,进一步在体外和体内验证靶点基因的功能;5、运用实时定量PCR、Western-blot等方法,在配对的肾癌和癌旁组织标本中验证靶点基因的表达水平和临床疗效的相关性;6、分析组织芯片及相应的临床数据,分析所得靶点在评价预后方面的价值。结果通过在体系统全基因组CRISPR/Cas9敲除文库模型的建立、数据生物信息分析、功能验证及结合临床预后分析,我们发现,体外特异性敲除SDHD后肾癌细胞系的增殖、侵袭能力和转移能力均有所提高,过表达该基因后则该效应不明显;同样的,在体内,敲除SDHD后细胞成瘤、转移能力增强,过表达可逆转该效应。分析TCGA、GEO等公共数据库及本中心临床标本发现,在肾癌患者中,SDHD表达水平越低,患者预后越差。结论SDHD在肾细胞癌中呈现抑癌基因的特性,其失活、变异可以促进肿瘤的增殖和转移。SDHD或成为肾癌基因靶向治疗的新靶点和预测肾癌预后的新型分子标志物。