论文部分内容阅读
目的：探讨人退变髓核细胞的体外分离、培养扩增及鉴定方法，并观察细胞微球三维培养对其生物学特性的影响。方法：收集25例人退变椎间盘手术髓核标本组织，体外采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法将原代髓核细胞分离并连续培养扩增传代。利用倒置相差显微镜观察髓核细胞形态变化，通过Ⅱ型胶原及aggrecan免疫荧光化学染色法鉴定髓核细胞类软骨表型分子的表达。分别采用常规单层培养和细胞微球三维培养退变髓核细胞，共设3个观察时间点（7、14、21天）。通过RT-PCR方法检测两组细胞aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9等基因的表达变化。结果：应用0.025%的Ⅱ型胶原酶37℃消化4小时即可分离出一定数量的原代人退变髓核细胞；体外培养观察发现其平均8天贴壁，细胞呈梭形、类圆形或多角性，细胞达到80%融合平均约需4周。免疫荧光化学及甲苯胺蓝染色法检测发现分离培养的髓核细胞可表达Ⅱ型胶原及aggrecan蛋白。RT-PCR检测结果显示细胞微球三维培养组髓核细胞aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白及SOX-9基因的表达显著高于单层培养组（P<0.05）。结论：采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法可从退变椎间盘手术标本中分离出一定数量退变髓核细胞。该细胞呈类软骨表型（表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原）。与常规单层培养相比，细胞微球三维培养可较好地保持其类软骨表型。目的：体外分离、培养扩增人脂肪组织来源的间充质干细胞，并通过流式细胞仪及多向诱导分化对其干细胞特性进行鉴定。方法：取10例剖腹产手术皮下脂肪标本，采用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化法结合反复贴壁法分离培养并纯化人脂肪间充质干细胞；倒置显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪检测干细胞表型分子。随后分别在单层和细胞微球三维环境下诱导人脂肪间充质干细胞定向成脂、成骨及成软骨分化，并采用油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色、甲苯胺蓝染色、aggrecan及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法检测。此外，应用RT-PCR方法检测单层诱导和细胞微球三维诱导环境下，人脂肪干细胞成软骨分化后的基因表达。结果：应用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化约1小时即可分离出较多的人脂肪间充质干细胞。原代人脂肪干细胞平均3天贴壁，达到80%融合约需9天；传至3代后，转变成均一的长梭形，并呈漩涡状排列。流式细胞仪检测分析发现人脂肪间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD105分子，低表达CD34、CD45分子及HLA-DR。单层环境下多向诱导21天后，油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色均呈阳性。细胞微球三维环境下成软骨诱导21天后，细胞团呈明显的软骨样形态，切片HE染色可见清晰的软骨特征样的细胞和细胞外基质分层排列。甲苯胺蓝、Masson三色染色、及II型胶原、aggrecan免疫组化染色均呈阳性。RT-PCR结果显示细胞微球三维环境下诱导的人脂肪干细胞软骨样表型基因（aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9）高于单层诱导组（P<0.05）。结论：通过Ⅰ型胶原酶消化结合反复贴壁法可获得大量纯化的人脂肪间充质干细胞，该细胞体外具有多向分化潜能，并且细胞微球三维诱导环境更适合其成软骨分化。目的：构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体并对其进行鉴定，以获得高滴度的携带LMP-1基因慢病毒载体用于脂肪干细胞的转染。观察LMP-1基因对细胞微球三维诱导环境下人脂肪间充质干细胞成软骨分化效应的影响。方法：根据人LMP-1基因（GeneBank序号：NM005451）mRNA，设计并合成全基因的引物。从购买的cDNA文库中，利用PCR方法钓取目的基因。将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。最后将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提得到较高滴度、可表达LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒载体。并分别用于转染脂肪干细胞得到表达LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干细胞。将转染LMP-1-GFP基因和GFP基因的人脂肪干细胞分别置于细胞微球三维环境中进行成软骨诱导分化。其中，转染LMP-1-GFP基因的脂肪干细胞分别采用含TGF-β3的成软骨诱导基和不含TGF-β3的成软骨基础诱导基进行成软骨诱导，同时用含TGF-β3的软骨诱导基对单纯表达GFP基因的脂肪干细胞进行成软骨诱导并设为对照组。诱导21天后，采用RT-PCR方法检测各组诱导细胞软骨表型基因的表达，观察LMP-1基因能否诱导细胞微球三维环境下人脂肪干细胞成软骨分化及其与TGF-β3诱导效应之间是否存在差异。结果：通过上述方法获得了高滴度（2x109TU/ml）的携带LMP-1基因的慢病毒。成软骨诱导对比实验表明TGF-β3诱导的转染LMP-1基因的人脂肪干细胞成软骨分化效应最强，其次为采用不含TGF-β3的成软骨基础诱导基诱导的转染LMP-1基因的脂肪干细胞，而采用含TGF-β3的成软骨诱导基诱导的转染GFP基因的人脂肪干细胞分化效应相对较弱，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：慢病毒是一种良好的基因转导载体工具，可有效地转染人脂肪干细胞并获得相关基因大量表达。与BMP-2、-7成软骨效应类似，LMP-1基因也可诱导细胞微球三维诱导环境下人脂肪干细胞成软骨分化，并且该效应高于传统的诱导因子TGF-β3。此外，两者之间存在协同效应。目的：观察并检测LMP-1基因对人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞在双层微球微球共培养环境下相互效应的影响，并分析相关机制。方法：采用携带LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒载体转染人脂肪间充质干细胞，获得表达LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干细胞。将其与退变髓核细胞在双层细胞微球三维环境下共培养，同时设立混合细胞微球三维共培养及单独细胞微球三维培养组作为对照。共设立7个细胞培养组，分别为转染GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组，转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组及髓核细胞三维细胞微球单独培养组。设立3个观察时间点：7、14、21天，采用阿利新蓝法检测各自蛋白聚糖含量，并通过流式细胞分选方法将表达GFP基因的脂肪干细胞与GFP表达阴性髓核细胞分离开来，采用RT-PCR方法检测共培养脂肪干细胞和退变髓核细胞各自aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达变化，并与单独培养组相比较。此外，我们还采用Western-blot蛋白免疫电泳法对各培养组脂肪干细胞上述基因变化在蛋白水平的表达进行了检测。结果：自培养的第14天起，双层细胞微球三维共培养组蛋白多糖合成高于其余各细胞培养组（P<0.05）,此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组蛋白多糖合成量显著高于转染GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组（P<0.05）。RT-PCR检测显示，自培养第7天起，细胞微球三维共培养组髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan等基因表达均高于单独髓核细胞三维微球培养组（P<0.05）。但双层细胞微球三维共培养组髓核细胞上述基因表达与混合细胞微球三维共培养组髓核细胞表达无显著性差异（P>0.05）。此外，与转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan基因表达高于与转染GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞（P<0.05）。此外，所有细胞微球三维培养组髓核细胞Ⅰ型胶原基因表达均随时间增长逐渐降低（P<0.05）。除I型胶原外，脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组未见上述基因表达。双层细胞微球三维共培养组脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组（P<0.05）。此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于转染GFP基因脂肪干细胞（P<0.05）。三维细胞微球单独培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达逐渐增高，但细胞微球三维共培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，除I型胶原外，双层细胞微球三维共培养组转染GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组转染LMP-1基因脂肪干细胞（P<0.05）。结论：双层细胞微球三维共培养较混合细胞微球三维共培养更有利于髓核细胞对脂肪干细胞的类软骨诱导效应，同时，LMP-1基因可增强此效应，但双层共培养方式占主导作用。此外，脂肪干细胞对髓核细胞具有一定的营养效应，LMP-1基因也可增强此效应，而细胞微球三维共培养方式（双层或混合）对该效应无明显影响（P>0.05）。