一、研究背景骨性关节炎是最常见的多因素引起的关节退行性疾病,以进行性的关节软骨损伤、软骨下骨硬化和关节周围骨赘形成为特征。关节疼痛是患者主要的临床表现。目前临床上对骨性关节炎的治疗没有特别有效的方法,主要以缓解患者症状及关节功能从而有限的改善患者生活质量为目标。关节置换是骨性关节炎晚期患者必需面临的选择。但是关节置换手术创伤大,花费高,同时也伴随着手术失败及后续翻修的风险。骨性关节炎已经为社会带来沉重的经济负担,同时在中国正逐步步入老龄化的今天,这种经济及社会负担将会进一步增加。目前找到一种有效的预防或治疗骨性关节炎的方法是迫切需要的。近期国内外研究团队在骨性关节炎发病机制方面所取得的进展为骨性关节炎的治疗提供了新的视点。越来越多的基础和临床研究支持骨性关节炎不仅仅是软骨病患,而是整个关节包括软骨和软骨下骨整体的疾病。软骨下骨为软骨提供力学支持,同时软骨下骨自身不断进行着动态的适度的重塑去适应周围微环境的变化。近期研究表明,在骨性关节炎发病进程中,软骨下骨在异常的力学刺激下骨吸收异常增加,在软骨下骨可见异常增多的TRAP细胞。增强的骨吸收激活释放过量的埋藏在骨基质中的阴性转化生长因子TGF-β,进而诱导异常的、骨吸收和骨形成未偶联的重塑：过量激活的转化生长因子TGF-β将骨髓间充质干细胞(MSCs)动员诱导至骨髓腔形成异位“骨岛”,而不能到达骨吸收部位去形成新骨以偶联骨吸收,从而改变了软骨下骨对关节软骨的应力刺激,最终引起关节软骨的破坏而诱发骨性关节炎的发生。目前对于骨性关节炎的发病机制的有几点共识：异常的力学刺激在骨性关节炎发病中发挥着重要的作用,这种异常的力学刺激将诱导软骨下骨进行异常的未偶联的骨重塑；骨性关节炎不仅仅是关节软骨疾病,软骨下骨与关节软骨是一对功能共同体,在骨性关节炎发病过程中相互协调、相互影响；骨性关节炎的发病是一个动态的、软骨下骨和关节软骨相互影响的以及是不断累积的过程。常山酮是从一种植物常山里所提取出来的物质。常山酮作为中药的成分被用来治疗疟疾在中国已有两千多年的历史。近期研究表明,常山酮可以被用来治疗纤维化的疾病,通知抑制转化生长因子TGF-β通路的smad2/3磷酸化；同时常山酮可以用来抑制Th17细胞的分化,而近年来研究表明Th17细胞可以分泌IL1 7诱导促进破骨细胞的分化从而增强骨吸收；血管形成也被认为是骨性关节炎发病的一个重要原因,亦有报道表明常山酮可以从多个阶段来抑制血管的形成。本研究旨在通过研究常山酮对转化生长因子TGF-β通路、Th17细胞分化以及血管形成方面的作用来探讨阐述骨性关节炎的发病机制,为骨性关节炎的预防和临床治疗提供一个新的视点和理论基础。二、研究方法(一)常山酮对骨性关节炎软骨下骨及关节软骨的影响1,动物模型的建立我们从Charles River购买了3个月大小的雄性的C57BL/6J (WT)小鼠和Lewis大鼠。鼠被分为三组：对照组、实验组给予常山酮及实验组给予安慰剂PBS。小鼠药物注射为腹腔内注射,剂量为1mg/kg,隔天一次,注射一个月。大鼠予以局部包埋药物。鼠在麻醉的状态下予以做前交叉韧带切断术(ACLT)以建立骨性关节炎模型。麻醉方法：购买的麻醉药有20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)及100mg/ml的Ketamine(克他命)。将20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)稀释至2mg/ml。我们用需要配制麻药的总体积数除以8.3以获得2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的体积数,再用总体积减去2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的体积数即为100mg/ml的Ketamine(克他命)的量。比如我们配制总体积数5m1的量,2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的体积为5/8.3=0.6m1,则100mg/ml的Ketamine(克他命)的量为5-0.6=4.4m1。将0.6m1的2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)与4.4 ml的100mg/ml的Ketamine(克他命)混合即为我们需要的麻醉剂。每只老鼠的用量(20-26克)约为100-120微升。老鼠麻醉后,将老鼠固定在显微镜的平台上,将老鼠将要做手术的腿固定屈曲90度以便于切断前交叉韧带。实验技巧：剪毛,只用酒精浸湿的纱布擦湿毛发即可,不要用喷雾器去喷,黏贴胶布打湿后很难再次黏住,给手术带来很多不必要的困惑；打开膝上皮肤,用镊子钝性分离皮下筋膜,避开皮下血管。从股内侧肌形成髌韧带的连接处剪开股内侧肌,注意避开股内侧肌肌肉内的血管,避免出血。此时的难点在于将髌骨推至外侧以暴露膝关节间隙。手术技巧在于用剪刀进一步剪开骨外膜,将骨外膜剪开后,即可轻易将髌骨推开。若不剪开骨外膜,即使花费很多时间处理髌骨下组织,也很难将髌骨推开同时会导致出血。暴露膝关节间隙后,用显微镊子拉开髌骨下脂肪垫,剪断前交叉韧带即可。后缝合伤口,碘酒外涂抹。手术做完后注意鼠的复苏,一般在鼠手术后将鼠放在40度左右的小电热毯上,大概在术后10-30分钟后鼠将复苏。此时,将鼠放回动物房,前交叉韧带切除(ACLT)模型建立成功。2,关节软骨各项指标的检测首先我们通过H&E和Safranin O and fast green染色来判断关节软骨大体的情况。关节从软骨至骨基本结构是：透明软骨、钙化软骨、软骨下骨生长版、软骨下骨、生长板及骨质结构。透明软骨与钙化软骨之间有一条tidemark线。以此tidemark线的上移与否可以判断关节软骨钙化的情况。Safranin 0染色可以把关节软骨染为红色,骨为绿色。在骨性关节炎的发病过程中,关节软骨退行性病变,会致使关节软骨糖蛋白丢失,使软骨着色变浅或者引起软骨下骨的浸润,有绿色骨组织出现。继而我们通过免疫染色去检测软骨分子蛋白的变化来进一步验证软骨的变化情况。我们选用的指标是Lubricin,(基质金属蛋白酶)MMP13及(胶原酶)Col X. Lubricin分布关节软骨的表明。大量实验证明,很多关节组织都分泌Lubricin,包括关节软骨细胞、滑膜细胞、半月板细胞以及交叉韧带细胞等。Lubricin主要作用为润滑膝关节,减少膝关节的摩擦力及滑膜等组织对软骨的浸润。在OA的进展过程中,Lubricin的表达量将会降低。关节软骨是有软骨细胞、Ⅱ型胶原分纤维及糖蛋白等物质组成。糖蛋白功能似“海绵”以吸收和释放关节周围的水分来适应关节力学的变化。Ⅱ型胶原纤维构成关节软骨的骨架蛋白。正常状态下,膝关节承受着正常的生理状态下的力学刺激,关节软骨进行正常的应力刺激去分泌Lubricin、Ⅱ型胶原纤维及糖蛋白去维持关节软骨的内稳定。然而当在创伤等条件下,膝关节将承受异常的力学刺激,关节软骨在异常的力学刺激将会发生复杂的分子生物学的变化,将会减少Lubricin及糖蛋白等的分泌。同时增加MMP13及Col X的分泌。MMP13主要裂解Ⅱ型胶原纤维以破坏关节软骨的结构。Col X是关节软骨肥大的指标,也是软骨破坏的指标。最后我们用Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores来对关节软骨的破坏程度给以量化评价。在评价量表中,总分等于等级乘以阶段(score=grade x stage)。等级共分为6个等级,第一个等级是关节表面是完整的(surface intact):在软骨表层可能伴随细胞的增生和坏死,但是软骨中下层没有波及到；第二个等级是表层不连续(surface discontinuity):表层软骨伴灶性原纤维形成,并可能延伸至中层软骨,在中层软骨里可能伴有细胞的增生和死亡；第三个等级是垂直裂纹从软骨表层延伸至中层(vertical fissures extending to mid-zone):同时侵入到中层的原纤维更多,并可能伴有裂纹延伸至软骨底层；第四个等级是侵蚀(erosion):可以观察到关节软骨基质的丢失,基质丢失的主要区域正在裂纹附近；第五个等级是裸露(denudation):钙化的软骨或软骨下骨直接暴露出来,微骨折见空隙可能被修复性的纤维软骨所占据；第六个等级是变形(deformation):较多的微骨折及修复性的纤维软骨,改变了整个关节软骨的轮廓。同时将OA的进程分为四个阶段。每个阶段意味着被破坏的关节面占整个关节面的比例,与OA的等级无关。第一个阶段表明受损的软骨占总软骨表明的10%；第二个阶段表明约占10%-25%；第三个阶段为25%-50%；第四个等级表明软骨表面损伤的面积超过总软骨表面的50%。我们以等级与阶段的乘积作为每个标本的最终评分。3,软骨下骨各项指标的检测首先我们使用三维micro-CT扫描骨组织结构来测骨微观结构的变化情况。我们将老鼠吸入麻醉安乐死(Forane),去鼠膝关节包括股骨下段和胫骨上段。后用10%福尔马林固定膝关节24小时(10% buffered formalin phosphate),后将10%福尔马林更换为1x PBS。标本使用高分辨率的三维CT扫描机扫描(SkyScan 1172),扫描后用三维CT重建软件对标本进行三维重建(NRecon v1.6),并使用分析软件对重建的三维CT扫描重建数据进行分析(CTAn v1.9 and CTVol v2.0)。我们将对软骨下骨的下列指标进行分析：总组织体积包括松质骨和皮质骨(TV);骨体积在同体积中所占有的量(BV/TV);松质骨厚度(Tb.Th),松质骨数量(Tb.N),松质骨分离度(Tb.Sp),连接密度(connectivity density),软骨下骨板厚度(SBP.Th)以及松质骨模式因子(trabecular pattern factor)。同时我们也对软骨下骨的骨重塑进行检测。我们用免疫染色的方法染色软骨下骨TRAP及Osterix的变化情况。TRAP主要反映软骨下骨破骨细胞变化情况,即骨吸收；Osterix是成骨细胞的标记mark,反映的是软骨下骨的骨形成。当我们将鼠膝关节前交叉韧带离断(ACLT)后,鼠膝关节将承受异常的力学刺激。增强的力学刺激会影响软骨下骨的骨重塑(bone remodeling),从而影响软骨下骨骨吸收(bone resorption)及骨形成(bone formation)的变化。(二)常山酮对骨性关节炎早期软骨下骨Th17细胞的影响1,检测Th17细胞在软骨下骨的变化情况我们首先通过免疫染色来确定软骨下骨Th17细胞的变化。Th17属于CD4+的免疫T细胞,其分泌IL17来发挥作用。实验中常采用CD4+IL17+双染阳性细胞来定义Th17细胞。我们认为在骨性关节炎发展的早期,即在鼠的前交叉韧带被切断的早期,膝关节因承受异常的力学刺激,而引起局部炎症反应。T细胞会渗透至软骨下骨内。渗透过来的T细胞会在软骨下骨微环境下分化为Th17细胞,因为股重塑过程中会释放出骨基质中的转化生长因子TGF-p,而转化生长因子TGF-P是Th17细胞分化的必须物质。鼠膝关节标本被三维CT扫描以后,放于脱钙液中3-4周进行脱钙(10% EDTA)。后石蜡包(paraffin)或者冰冻包埋(OTX:optional cutting temperature)。组织切片时切片厚度为4微米。同时我们使用流式细胞(flow cytometry)进一步验证Th17细胞的变化。我们去老鼠的骨髓和外周血。老鼠给予吸入麻醉(forane),外周血采用心脏抽血的方法,每只鼠约600-1000微升。取骨髓通过将长骨两端剪开,使用注射器冲洗。后将骨髓及外周血按相应处理进行流式细胞分析。除此之外,我们进一步做了术后不同时间段Th17含量的变化。我们取术后2周和1个月作为时间点去验证Th17的变化是否随时间的变化而变化。2,检测软骨下骨RANKL量的变化我们采用免疫荧光染色的方法去定量软骨下骨RANKL含量。RANKL是破骨细胞分化的必须物质。在软骨下骨的微环境中,Th17将分泌IL17因子作用于软骨下骨的成骨细胞上,成骨细胞将分泌RANKL作用于破骨细胞前体细胞而促进破骨细胞的形成而促进骨吸收。即为软骨下骨在异常应力刺激下进行异常骨重塑的先决条件。(三)常山酮对软骨下骨MSCs细胞TGF-β介导的smad2/3信号通路的影响1,体外培养MSCs, Western Blot观察常山酮对TGF-β通路的影响我们从Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute获得GFP标记的成年鼠骨髓间充质干细胞MSCs。细胞传至3-5代获得我们所需要的细胞量一部分进行试验一部分液氮冻存。培养基为Iscove’s modified Dulbecco’s medium (Invitrogen),辅以10% FCS (Atlanta Biologicals)、10%马血清(Thermo Scientific)以及1%青霉素-链霉素溶液(Mediatech)。细胞被培养在6孔板上,细胞的密度为1.8×105/每孔。待细胞长满培养皿后,提前予以添加常山酮(sc-211579, Santa Cruz Biotechnology)预处理4小时、8小时及12小时。于添加转化生长因子TGF-β (R&D Systems)前,饥饿细胞4小时。转化生长因子TGF-β与细胞作用30分钟。后提取蛋白,每孔加200微升的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂的混合溶液。所有操作在冰上进行。提取完蛋白后,将放于蛋白的试管放于冰中1小时,每10分钟震荡一次。后离心,13.2×103rpm,4度,10分钟。将离心后的蛋白定量。后取适度的蛋白的与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)混合,100度水浴5-10分钟。蛋白电泳跑胶,首先配胶。10%下层胶(2块)：5.99毫升dd H2O、3.8ml PH8.8的下层胶缓冲液、5.01ml 30%ACR、224微升10% APS及10微升TEMED.8%上层胶(2块)：4毫升dd H2O、1.77ml PH6.8的下层胶缓冲液、1.2ml 30% ACR、112微升10%APS及10微升TEMED.将蛋白加样,60伏2-3小时。后将蛋白转膜至PVDF膜。后洗3遍,5分钟每次,5%milk封闭1小时,加入一抗4度过夜。第二天,取出放在室温下20-30分钟,回收一抗。有洗液洗6遍,10分钟每次。加入二抗室温下1小时,后洗6遍,10分钟每次。后暗室内显色获得实验结果。2,动物体内实验免疫染色MSCs和磷酸化的smad2/3我们应用免疫组化及免疫荧光的方法在动物体内进一步验证常山酮对软骨下骨转化生长因子TGF-β信号通路的影响。转化生长因子TGF-β信号通路的机制是细胞外的转化生长因子TGF-β配体与细胞膜上的转化生长因子TGF-β受体Ⅱ结合,后转化生长因子TGF-β受体Ⅱ将动员招募转化生长因子TGF-β受体Ⅰ,从而形成转化生长因子TGF-β受体复合物。受体复合物继而诱导smad2/3磷酸化,磷酸化的smad2/3将于smad4结合形成复合物进而转至核内,转至核内的smad2/3和smad4的复合物将于相应基因结合,促进或抑制相应基因的转录和翻译,从而发挥其作用。免疫组化染色psmad2/3。实验分组动物被执行安乐死后,我们取鼠手术组及对照组的膝关节包括股骨下段和胫骨上段。先将膝关节固定24小时,三维CT扫描后更换为脱钙液(10% EDTA)脱钙3-4周。后将组织石蜡包埋,切片。切片厚度为4微米。切好的片子放于56度半小时,后保存于4度。染片时,前一天将片放于65度过夜。第二天,取出放于室温20-30分钟。依次过zylene3遍、100%酒精2遍、95%酒精及80%酒精。标本TBST洗3遍,5分钟每次。同时配制1x抗原修复液预热于65度,将标本加入65度1x抗原修复液20分钟,后转至99.9度20分钟,后室温20分钟。倒掉抗原修复液,TBST洗3遍,5分钟每次。封闭笔花圈,加0.6%过氧化氢(H202)封闭10分钟。TBST冲洗,5分钟后再次冲洗放5分钟。后加3%BSA封闭1小时。配制一抗,加一抗4度过夜。第二天,拿出标本室温下放置20分钟。TBST洗涤3次,15分钟每次。加入二抗,室温放置1小时。TBST洗三次,每次15分钟。DAB显色,注意把握时间。复染细胞核(Hemotoxylin)约5-8秒。龙头水冲洗一次。醋酸(acetic acid)5秒,后氨水(ammonia water)约1分钟。一次过95%酒精、100%酒精两次及xylene3次。封片,照片采集。4度保存。(四)常山酮对软骨下骨异常血管形成的影响1,血管造影我们采用基于三维CT的血管造影来检测在骨性关节炎发病过程软骨下骨血管的变化情况。方法是当给予鼠安乐死后,打开胸腔找到有心室用针尖扎个孔,或用剪刀剪破。后从左心室进针冲洗整个体循环。首先给予20m1100u/ml的肝素(heparin)冲洗,预防并避免体循环内凝血。后给予20m1的10%的福尔马林(10% buffered formalin phosphate)固定。再以一定配比给予造影剂,可见肝脏明显变黄。造影剂尽量每次只配一只老鼠的量,因其容易凝固而致浪费。后将老鼠放置4度1到2天,然后解剖得到膝关节标本,并放于福尔马林里固定24小时。放于脱钙液中脱钙(10% EDTA)3-4周。三维CT扫描,获得血管造影CT图片。后用CT分析软件分析所得到的数据(CTAn v1.9 and CTVol v2.0).2,免疫荧光染色CD31及Endomucin验证软骨下骨血管情况我们通过使用免疫荧光染色进一步验证软骨下骨血管形成情况。我们使用免疫荧光双染CD31及Enmucin来确定H型血管(CD31+ Endomucin+)的变化。H型血管(CD31+ Endomucin+)是一种特殊类型的血管,他只出现在骨系统中,在其他系统或组织中阴性。同时在骨系统中,H型CD31+ Endomucin+血管只出现在骨形成时期,即此血管主要作用是偶联血管形成和骨的形成。血管形成可以为骨的形成提供所必须的MSCs和EPCs,同时也为骨提供氧气和营养物质以及排除细胞代谢所产生的废物和垃圾。免疫荧光染色方法是将老鼠安乐死后,取膝关节标本包括股骨下段和胫骨上段。同时将标本固定24小时后,脱钙3-4个星期。后冰冻包埋(OTX:optional cutting temperature),-80度保存。冰冻切片时标本厚度为0.4微米。后将标本放于室温1-2小时。染色时不用像免疫组化那样将标本提前放56度过夜。冰冻染色只需当天拿出标本放于室温1小时：室温20分钟,40度20分钟,后室温再20分钟。后用TBST洗3次。抗原修复液修复：现将抗原修复液预热至65度,后将标本放于65度抗原修复液中20分钟,后99度20分钟。放置室温下20-30分钟。将修复液倒掉,TBST洗3遍,5分钟每次。放于湿盒内,吸干花圈。加入3%BSA封闭1个小时。后加入一抗4度过夜。第二天,取出标本,放于室温下20-30分钟。TBST洗3次,15分钟每次。加入二抗,室温下放置1小时。注意此是荧光染色,加入二抗后一定要注意避光,盖上一层锡纸放于室温摇床上1小时。后TBST洗3遍,每遍15分钟。因此是免疫双染,因同时加入两个一抗是容易相互发生反应,使结果不准确,我们多采取分次加入一抗。此时,洗过后,再次用3% BSA封闭1小时,加入第二个一抗1小时,4度过夜。第二天取出步骤同上,再次加入第二个二抗,同样避光放于室温1小时。后TBST洗3遍,15分钟每次。最后DAPI封片,显微镜下采集照片。定量计数。分析数据。三、实验结果1,常山酮对骨性关节炎软骨下骨及关节软骨的影响我们发现常山酮缓解了关节软骨的破坏。H&E染色显示在非常山酮治疗组中关节软骨的tidemark线上移,而常山酮治疗抑制了这一现象。Tidemark线将关节软骨分割为上方的透明软骨和下方的钙化软骨。Tidemark线的上移表明钙化软骨的增多,意味着关节软骨的破坏增加。常山酮抑制了Tidemark线的上移,意味着常山酮保护了关节软骨。Safranin O染色进一步表明常山酮治疗缓解了关节软骨表面糖蛋白的降解。Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores在三组动物中有显著差异(F=136.360,P<0.001)。与安慰剂治疗组相比,常山酮组老鼠的OARSI分值显著降低(P<0.001)。我们进一步通过免疫染色,骨性关节炎发病过程中,Lubricin, MMP-13及Col X等分子的表达发生改变,lubricin表达在三组动物中有显著差异(F=49.603,P<0.001),其中骨性关节炎组较对照组显著降低,降低意味关节间的摩擦力增加,关节破坏增加；MMP-13和CoL X的表达在三组间均有显著性差异(F=26.361, P<0.001; F=109.328, P<0.001),而与对照组相比,骨性关节炎组MMP-13和Col X的表达增加,MMP-13可以降解关节软骨中的Ⅱ型胶原纤维,而Col X表明关节软骨细胞的肥大,都表明软骨的破坏增加。我们前期临床结果已表明,在骨性关节炎的发病过程中,软骨下骨过度的骨吸收释放激活的过多的转化生长因子TGF-β。过多的转化生长因子TGF-β打破了原来软骨下骨中正常的转化生长因子TGF-β浓度梯度,从而将骨髓间充质干细胞MSCs动员诱导至骨髓腔形成异位骨岛,而非将骨髓间充质干细胞诱导至骨吸收部位以偶联骨吸收,最终诱导关节力学环境的环境的改变,诱导了关节软骨的破坏并最终发展成骨性关节炎。因此我们假设如果抑制了软骨下骨转化生长因子TGF-β的信号通路,将骨髓间充质干细胞MSCs重新诱导至骨吸收表面以偶联骨吸收,将会缓解骨性关节炎的发生。因此我们选择了常山酮。常山酮以抑制转化生长因子TGF-β信号通路被临床用于治疗纤维化等疾病。与以前结果相吻合,我们发现老鼠前交叉韧带(ACLT)被离断后,软骨下骨的骨微观结构发生改变,三维CT扫描表明,安慰剂治疗组中鼠膝关节软骨下骨的总组织量(TV)增加,软骨下骨松质骨模型因子(Tb.pf)增加,同时软骨下骨板的厚度(SBP)减少,这些都表明软骨下骨正常的骨重塑遭到破坏。我们通过进一步的免疫染色验证软骨下骨骨重塑的情况。TRAP染色表明安慰剂治疗组软骨下骨破骨细胞增多,意味着软骨下骨的骨吸收增加。而常山酮抑制了软骨下骨破骨细胞数量的增加。Osterix染色与TRAP染色一致,安慰剂治疗组Osterix阳性细胞数量明显增加,且增加的Osterix阳性细胞聚在软骨下骨骨髓腔,而并没有被招募到骨吸收部位去偶联骨吸收。常山酮治疗抑制了软骨下骨Osterix阳性细胞的增加,同时Osterix阳性细胞位于骨吸收部位去偶联骨吸收。所有数据表明常山酮通过调节软骨下骨骨重塑保护了关节软骨不受破坏并最终抑制了骨性关节的发生。2,常山酮对骨性关节炎早期软骨下骨Th17细胞的影响Th17细胞可以通过分泌IL17来调控RANKL的分泌,来调节破骨细胞的成熟和分化。在本实验模型情况下,骨性关节炎发病早期,由于前交叉韧带被切断导致关节不稳,关节不稳则引起关节应力发生改变而导致异常应力刺激。而引起关节的局部炎症反应,如炎症细胞的渗出,包括CD4阳性的T细胞。同时由于软骨下骨在骨重塑的情况下,会释放活化的转化生长因子TGF-β以偶联骨形成和骨吸收。同时,转化生长因子TGF-β也是CD4+T细胞分化为Th17细胞的必要条件。因此,软骨下骨的转化生长因子TGF-β为渗出的CD4+T细胞分化为Th17细胞的提供的了完美的环境。Th17细胞分化完成后,Th17细胞可以分泌IL17因子。IL-17主要作用于骨髓基质细胞或成骨前体细胞,促进骨髓基质细胞或成骨前体细胞分泌RANKL。RANKL则会作用于破骨前体细胞,促进破骨前体细胞的成熟并最终分化破骨细胞去吸收骨质。通过免疫荧光染色我们发现,在前交叉韧带离断(ACLT)模型下,安慰剂治疗组的软骨下骨Th17的数量在术后2周显著增高。而常山酮抑制了Th17的细胞的增多。我们进一步确认Th17细胞数量的升高是不是有时间依赖性。我们发现,Th17细胞的数量到达峰值后(2周),会随着时间的继续推移而数量下降。数据显示在术后1个月,Th17细胞的数量回到正常的水平。同时我们采用流式细胞(flo wcytometry)的方法进一步确认在骨性关节炎发病早期Th17细胞的变化情况。我们分别取鼠的骨髓和外周血。流式细胞结果与免疫荧光结果相似,我们发现在术后2周Th17细胞在骨髓中中显著升高,这种增多同样具有时间依赖性,在术后1个月时,Th17细胞的数量又回到对照组的水平。但是,Th17细胞在外周血中的含量,无论是术后2周还是术后1个月,均没有发生显著性差异。同时我们应用免疫荧光的方法定量RANKL在软骨下骨的表达。如前所述,Th17细胞是通过分泌IL17因子作用于骨髓基质细胞或成骨前体细胞,以促进骨髓基质细胞或成骨前体细胞来分泌RANKL来最终促进破骨细胞的成熟及骨吸收。因此我们免疫荧光染色RANKL去验证是否软骨下骨Th17伴随着RANKL含量的增加。我们发现,安慰剂治疗组软骨下骨RANKL的表达胶对照组显著增加,同时常山酮的抑制了RANKL的表达。这些数据进一步说明,常山酮可以抑制软骨下骨的骨吸收通过抑制Th17的分化及其所诱导的RANKL配体含量的表达。3,常山酮对软骨下骨MSCs细胞TGF-β介导的smad2/3信号通路的影响骨性关节炎的发生,是基于关节受到异常的力学刺激,引起关节软骨释放激活过多的转化生长因子TGF-β,过多转化生长因子TGF-β破坏了原来关节内的溶度梯度,从而将骨髓间充质干细胞MSCs诱导至骨髓腔形成异位骨岛从而诱导骨性关节炎的发生。正常受力情况下,关节软骨下骨进行着正常的骨重塑,即破骨细胞吸收骨质,同时激活释放储存在骨基质中的转化生长因子TGF-β,转化生长因子TGF-β作用于骨髓间充质干细胞(MSCs),激活smad2/3通路TGF-β通路,从而将作用于骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导至骨吸收表面,以偶联骨吸收和骨形成。然而在鼠膝关节前交叉韧带被切断的情况下,关节承受着异常的力学刺激,导致过多的骨吸收同时释放过多的转化生长因子TGF-p,因此激活了过多的MSCs的smad2/3通路。使骨髓间充质干细胞MSCs在骨髓腔内被原位激活,从而诱导了异位骨岛在软骨下骨的形成。我们染色发现,骨髓间充质干细胞MSCs在安慰剂治疗组鼠软骨下骨内显著增加,且增加的骨髓间充质干细胞MSCs位于软骨下骨骨髓腔内,而不是位于骨吸收部位去偶联骨吸收和骨形成。同时,常山酮抑制了骨髓间充质干细胞MSCs的数目的增加,并且将骨髓间充质干细胞MSCs重新诱导至骨吸收表面去偶联骨形成。为了进一步去验证转化生长因子TGF-β是直接作用于骨髓间充质干细胞MSCs,激活骨髓间充质干细胞MSCs内的TGF-β通络,诱导MSCs细胞内smad2/3磷酸化。我们做了体外细胞培养及Western blot实验。实验结果表面,TGF-β可以直接激活骨髓间充质干细胞MSCs内的TGF-β通路诱导smad2/3磷酸化。然而若提前给予细胞常山酮处理,将会降低骨髓间充质干细胞MSCs的smad2/3的磷酸化。同时我们发现,常山酮对骨髓间充质干细胞MSCs的smad2/3磷酸化的抑制具有时间和剂量依赖性。smad2/3的磷酸化会随着剂量的不断增大而减少,当剂量达到1000nM时,smad2/3的磷酸化被完全抑制。同时,当我们增加常山酮的作用时间时,对smad2/3的磷酸化的抑制强度也逐渐增强。我们在动物实验上进一步验证了常山酮对smad2/3磷酸化通路的影响。我们发现鼠行前交叉韧带离断术后(ACLT),软骨下骨的psmad2/3显著增加。给予常山酮治疗显著降低了psmad2/3的含量(F=8307.104,P<0.001))。这些实验结果表明,常山酮可以直接作用于骨髓间充质干细胞MSCs,抑制MSCs的TGF-β信号通路,抑制smad2/3的磷酸化。从而调节了软骨下骨未偶联的骨重塑,并最终延缓了骨性关节炎的发生和进展。4,常山酮对软骨下骨异常血管形成的影响软骨下骨的异常血管形成对骨性关节炎的发生至关重要。骨性关节炎的发病过程中,软骨下骨血管的数量和体积均增加。异位骨岛的形成在骨性关节炎的发病过程中的作用至关重要。血管为骨岛的形成提供所必须的MSCs,同时也为骨组织提供必需的氧气及营养物质。我们通过基于三维CT的血管造影的发现,在骨性关节炎的发病过程中,软骨下骨的血管数量和总量均增加。同时常山酮抑制或减少了软骨下骨血管的体积和数量。骨的形成总是伴随着血管的生成。H型血管,是最近刚被筛选出来的一种只出现在骨组织的血管,且只在骨形成的过程中,即这种H型血管偶联了骨的形成和血管的形成。这种血管以双染CD31和Endomucin均阳性为特征(CD31+ Endomucin+)。在骨性关节炎的发病过程中,异常的骨质增生即异常的异位骨岛形成在骨性关节炎发病过程中起了重要的作用。软骨下骨异位骨岛改变了关节内的受力环境,使软骨经受异常的力学刺激,而引起关节软骨基质的破坏及软骨的退行性病变。CD31+ Endomucin+血管是一种特异的偶联骨形成的血管。因为我们认为在骨性关节炎发病过程中,软骨下骨异位骨岛的形成伴随着CD31+ Endomucin+血管的形成,因其偶联骨形成。因此我们做了免疫双染。免疫结果显示,前交叉韧带离断术后(ACLT),鼠软骨下骨CD31+ Endomucin+血管的数量明显增加,同时,常山酮抑制了CD31+Endomucin+血管的生成。这种抑制可能是由于常山酮抑制了TGF-β信号通路,从而减少了MSCs细胞的动员和招募,MSCs可以和内皮前体细胞(EPCs)相互作用以促进骨形成。同时我们在试验中还发现,常山酮除了抑制转化生长因子TGF-p的信号通路外,在抑制血管形成的作用中,常山酮还抑制了血管内皮细胞的增生。我们发现,安慰剂治疗组的鼠软骨下骨内皮细胞的增生明显增加,而常山酮组软骨下骨内皮细胞的增生与对照组相似,意味着常山酮抑制了血管内皮细胞的增生。同时我们还发现常山酮抑制了基质金属蛋白酶(MMP-2)的活性。基质金属蛋白酶(MMP-2)是在血管形成中研究较多的一种蛋白酶,主要作用血管基底膜的Ⅳ型胶原纤维,裂解Ⅳ型胶原纤维以促进新生血管形成。我们发现安慰剂治疗组基质金属蛋白酶(MMP-2)的含量明显增高,而常山酮明显降低了基质金属蛋白酶(MMP-2)了含量。综上所述,常山酮可以通过抑制异常血管的形成来调节软骨下骨的骨重塑并最终缓解骨性关节炎的发生。四、结论1,常山酮缓解了关节软骨的破坏从而延缓了骨性关节炎的发生,这一作用是通过调节软骨下骨的异常的骨重塑抑制软骨下骨异位骨岛的形成来实现的；2,常山酮抑制了软骨下骨Thl7细胞从而减少了软骨下骨异常增多的骨吸收进而减少了过多的活性的TGF-p的释放；3,常山酮抑制了骨髓间充质干细胞MSCs的TGF-β依赖的smad2/3信号通路。4,常山酮抑制了软骨下骨异常的血管形成。