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雄激素受体(androgen receptor, AR)是一类配体依赖性的转录因子,属核受体家族成员,在维持正常前列腺细胞生长及前列腺癌发生发展过程中起重要调控作用。早期前列腺肿瘤的生长对雄激素有依赖性,阻断雄激素是治疗早期前列腺癌的有效方法,但这种治疗手段容易引起癌细胞对雄激素非依赖性的生长。过去认为激素非依赖性前列腺癌中缺乏AR蛋白,但近年研究发现,长期应用内分泌治疗失败的雄激素非依赖型前列腺癌细胞中的AR表达水平和AR阳性细胞并无明显减少,甚至有过表达。由于AR扩增、突变、过表达及AR共活化物的改变、AR功能增强以及旁开放等因素,导致了在雄激素去除后前列腺癌细胞的幸存和雄激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖。由此看来,无论在激素依赖性或非依赖性前列腺癌中,阻断AR表达、抑制其功能活性都是有效的治疗靶向。新近研究发现,miRNA在人类的多种疾病中,包括肿瘤的病理过程中发挥重要作用。miRNA可作为抑癌基因下调原癌基因活性,也可作为癌基因下调抑癌基因活性,其自身突变、缺失、易位及相互调控异常等可导致相关基因异常表达,涉及肿瘤发生发展的全过程。据研究报道miR-185在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用,可抑制肺癌、乳腺癌、卵巢癌、大肠癌及肾癌细胞的增殖,在不同的肿瘤细胞中miR-185可能通过不同的机制抑制细胞的增殖。在我们的研究工作中发现,miR.185也可抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖,为进一步探讨miR-185抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的机制,通过miRDB数据库查询miR.185作用的靶基因,发现AR是miR-185的靶基因之一。进一步采用实时定量PCR(Real-time PCR)、Western blot检测miR-185对AR mRNA和蛋白的影响；运用基因重组技术,构建AR3＇非翻译区(3’UTR)-荧光素酶报告基因质粒和雄激素反应元件(ARE).荧光素酶报告基因质粒,荧光素酶活性检测miR.185对AR-3’UTR的作用及miR-185对AR-ARE相互作用的影响；采用MTT法和Hoechest33258法检测miR.185对LNCaP细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,AR是miR-185直接作用靶基因,miR-185可通过结合到AR-3’UTR特异性位点抑制AR mRNA的活性,降低AR蛋白表达水平,并进一步影响AR-ARE相互作用及其介导的信号途径,调节靶基因PSA和NKX3.1的表达,抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖,促进细胞凋亡。我们的实验结果表明,miR-185在前列腺癌细胞中发挥抑癌作用,为临床进一步探讨前列腺癌的分子机制提供实验依据,并为临床前列腺癌的治疗提供新的作用靶点。第一部分miR-185对前列腺癌LNCaP细胞中AR表达的调控作用目的：研究miR-185对前列腺癌LNCaP细胞中AR表达的调控作用,探讨miR.185抑制LNCaP细胞生长的作用机制。方法：1. Real-time PCR检测miR.185对AR mRNA水平的影响：将LNCaP细胞接种到6孔板中,并使用siPORTTM NeoFXTM分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,收集转染48h、72h总RNA。反转录并使用Real-time PCR检测miR-185与AR mRNA表达水平,分别以GAPDH为内参。2. Western blot检测miR.185对AR蛋白水平的影响：采用siPORTTM NeoFXTM分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,收集转染48h和72h细胞总蛋白,Western blot检测AR蛋白的表达水平,以β-Actin为内参。3.构建AR3’UTR-荧光素酶报告基因质粒：采用PCR方法扩增得到野生型人AR3’UTR,并插入到pMIR-REPORT质粒中荧光素酶基因的3＇下游区,构建成野生型AR-3’UTR-荧光素酶报告基因质粒pMIR-AR-3’UTRw。进一步采用PCR方法,将野生型AR-3’UTR中的miR-185作用位点缺失,构建成miR-185位点缺失的AR-3’UTR-荧光素酶报告基因质粒pMIR-AR-3’UTRm。4.荧光素酶活性检测miR.185对AR-3’UTR的作用：采用siPORTTM NeoFXTM分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,培养48h,采用FuGene HD转染试剂分别将pMIR-AR-3’UTRw、pMIR-AR-3’UTRm和参照质粒pRL-TK再次转染细胞,培养48h,收集细胞裂解液,进行双荧光素酶活性测定。结果：1. Real-time PCR结果显示：转染miR-185mimic和inhibitor对AR mRNA水平无明显影响。2. Western blot结果显示：LNCaP细胞转染miR-185mimic72h,AR蛋白的表达明显降低；LNCaP细胞转染miR-185inhibitor72h,AR蛋白的表达升高。3.双荧光素酶活性检测结果显示：与对照组相比,miR-185可明显抑制pMIR-AR-3’UTRw荧光素酶活性,miR-185inhibitor可明显增加pMIR-AR-3’UTRw荧光素酶活性；而miR-185mimic、Normal Control mimic、 miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor对pMIR-AR-3’UTRm无明显影响。结论：AR是miR-185直接作用的靶基因,miR-185可直接作用于AR-3’UTR的靶点抑制AR蛋白的表达。第二部分miR-185对AR-ARE相互作用及其介导的信号途径的影响目的：研究miR-185对AR-ARE相互作用及其介导的信号途径的影响,探讨miR-185抑制LNCaP细胞生长的作用机制。方法：1.构建pGL4-ARE重组质粒：人工合成双拷贝ARE正反义链,退火生成双链ARE,并将其克隆至荧光报告质粒pGL4.23[luc2/minp]的TATA盒上游,构建成pGL4-ARE重组质粒,筛选的质粒经酶切和测序鉴定。2.双荧光素酶活性测定miR.185对AR-ARE相互作用的影响：将LNCaP细胞接种到48孔板中,采用siPORTTM NeoFXTM试剂分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,培养48h,采用FuGene HD转染试剂分别将pGL4-ARE或pGL4.23[luc2/minp]空质粒和内参pGL4-TK质粒再次转染细胞,培养48h,收集细胞裂解液,进行双荧光素酶活性测定,检测miR-185对AR-ARE相互作用的影响。3. Real-time PCR检测miR.185对AR靶基因NKX3.1和PSA表达的影响：采用siPORTTM NeoFXTM试剂分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,收集72h总RNA。Real-timePCR检测NKX3.1和PSA mRNA的表达水平,以GAPDH为内参。结果：1.构建的pGL4-ARE重组质粒,经酶切和测序鉴定正确。2.双荧光素酶活性检测结果显示：与对照组相比,miR-185降低40.5%pGL4-ARE的荧光素酶活性,miR-185inhibitor可增强30.8%pGL4-ARE荧光素酶活性。3. Real-time PCR结果显示：与转染NC mimic相比,转染miR-185mimic后NKX3.1和PSA mRNAs的表达水平降低；与转染NC inhibitor相比,转染miR-185inhibitor后,NKX3.1和PSA mRNAs的表达水平升高。结论：miR-185下调AR蛋白表达,可影响AR-ARE相互作用,进而下调AR靶基因NKX3.1和PSA的表达。第三部分miR-185对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响目的：研究miR.185对前列腺癌LNCaP细胞增殖和凋亡的影响方法：1.MTT法检测miR-185对前列腺癌细胞LNCaP和PC-3增殖的影响：采用siPORTTM NeoFXTM试剂分别将miR-185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、 Normal Control inhibitor转染LNCaP和PC-3细胞,在96孔板中继续培养24h、48h、72h、96h,MTT法检测细胞增殖。2. Hoechest33258法检测miR-185对细胞凋亡的影响：采用siPORTTM NeoFXTM试剂分别将miR.185mimic、Normal Control mimic、miR-185inhibitor、Normal Control inhibitor转染LNCaP细胞,继续培养72h、96h、120h,Hoechest33258法检测细胞凋亡。结果：1.MTT结果显示：miR-185可明显抑制LNCaP细胞增殖,其中转染96h与对照组相比抑制效果达29.8%；miR-185inhibitor可促进LNCaP细胞增殖,其中转染96h与对照组相比促进效果达15.9%。按照相同方法检测PC-3细胞的增殖,结果显示各转染组之间细胞增殖无明显差异。2. Hoechest33258染色结果显示：与对照组相比,转染miR-185后LNCaP细胞中染色质分割成块状,凋亡小体数量增加,染色质浓缩、边缘化,核膜裂解；而转染miR-185inhibitor后LNCaP细胞中凋亡小体减少。结论：miR-185过表达可抑制LNCaP细胞增殖,促进细胞凋亡,反之抑制miR.185可促进LNCaP细胞增殖,抑制细胞凋亡；而miR-185对PC-3(AR表达阴性)的生长没有明显影响；在LNCaP细胞中miR-185可能通过下调AR表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。