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在小麦与叶锈菌的互作过程中,不亲和组合小麦通过产生过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)抵御叶锈菌的侵袭。通过阎爱华等构建的叶锈菌侵染早期的小麦SSH文库进行ESTs序列分析,筛选到TaADOR(Triticum aestivumascorbate-dependent oxidoreductase)基因,在不亲和组合接种后的早期表达显著上调,推测TaADOR基因参与了小麦与叶锈菌互作。本研究以小麦与叶锈菌互作体系为研究对象,利用小麦品种洛夫林10(L10)和两种叶锈菌生理小种260和165,探究TaADOR基因在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。本试验借助前期构建的小麦TaADOR基因的RNAi表达载体,利用农杆菌介导的小麦成熟胚转化体系进行遗传转化,对T1代转化植株进行TaADOR功能验证,为进一步研究TaADOR基因在小麦抗叶锈菌侵染过程中的作用奠定基础。本研究主要获得以下结果: 1.通过Western Blotting技术检测TaADOR蛋白在小麦与叶锈菌互作后不同时间点翻译水平的表达量变化。不亲和组合中,TaADOR在4-16h的表达呈下降趋势,恢复至正常水平后表达量明显上升。亲和组合中,TaADOR在0-16h的表达量呈上升趋势,然后缓慢下降,至72h依然有较高的表达量。TaADOR蛋白在不同亲和性组合的差异表达,表明其参与了小麦抵抗叶锈菌互作的防卫反应。 2.通过Southern Blotting技术检测确定获得单拷贝的TaADOR-RNAi阳性植株。 3.在T1代TaADOR-RNAi转化植株上接种叶锈菌生理小种260,通过DAB染色发现由叶锈菌侵染诱发的H2O2的积累要比转化空载体植株积累的H2O2多,证明TaADOR基因参与了H2O2的清除。 4.在T1代TaADOR-RNAi转化植株上接种叶锈菌生理小种260,经过Rohringer荧光染色观察发生HR的叶肉细胞,发现TaADOR-RNAi转化植株的HR扩展面积要大于转化空载体植株。推测沉默TaADOR基因后,H2O2含量上升,进而诱发HR的扩展,表明TaADOR基因负调控小麦抵抗叶锈菌侵染产生的HR。 5.对L10七日龄小麦幼苗喷施SA,通过RT-qPCR检测TaADOR的表达量变化,发现其在16h时高表达,且一直持续到120h恢复本底表达水平。对照组在接种前期处于低表达水平,虽然在8-16h时也有高表达,但远远低于试验组。表明TaADOR基因受SA的诱导。 6.对T1代TaADOR-RNAi转化植株接种叶锈菌生理小种260,通过RT-qPCR检测自噬相关基因TaATG6拘表达量,发现其在接种8-16h时有高的表达量并且在16h达到最大。对照组在接种8-16h时高表达,然后恢复至本底表达水平。推测沉默TaADOR基因后,细胞内H2O2大量积累,进而诱发自噬的产生。 综上所述,TaADOR基因参与了细胞内H2O2的清除,初步表明TaADOR基因受到SA的诱导并且TaADOR基因对细胞自噬起到一定调控作用。