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乙酰酯酶是碳水化合物酯酶家族中的重要成员,也是木聚糖降解酶系中一个重要组成部分,在制药、造纸和生物质利用等领域有较大需求。目前国内尚未有乙酰酯酶的工业生产的相关报道,同样关于乙酰酯酶增强表达的学术研究也十分缺乏,因此采用合理的途径提高工程菌株产乙酰酯酶能力是十分必要的。本研究试图通过启动子多拷贝策略增强大肠杆菌乙酰酯酶的产量。首先对大肠杆菌RB3乙酰酯酶基因yba C进行克隆和测序,构建了克隆载体p T-yba C,随后构建了1拷贝tac启动子表达载体p K-yba C并成功构建了1拷贝tac启动子工程菌(ECON);随后通过In-Fusion法构建了2拷贝tac启动子工程菌(ECTW)、3拷贝tac启动子菌株(ECTH)和5拷贝tac启动子工程菌(ECFI)。分别检测5株乙酰酯酶工程菌发酵过程中不同时间乙酰酯酶酶活力和yba C基因转录水平,同时对粗酶液中乙酰酯酶纯化并进行酶学性质研究。论文的研究结果如下:(1)通过参考NCBI已登录的yba C基因序列,利用软件Primer 5.0设计了针对大肠杆菌RB3中yba C基因特异性引物,经过PCR条件摸索,最终完成了yba C基因的扩增,测序后将序列结果上传至NCBI(Gen Bank accession No.KM489072)。(2)通过重组克隆载体p T-yba C和重组表达载体p K-yba C的构建,转化大肠杆菌JM110后获得1拷贝tac启动子工程菌ECON,提取工程菌质粒进行双酶切和测序验证。(3)通过设计并人工合成多拷贝tac启动子DNA片段,在载体p K-yba C基础上利用In-Fusion法构建了含有2、3和5拷贝tac启动子的重组质粒p KTW-yba C、p KTH-yba C和p KFI-yba C,转化大肠杆菌JM110后分别得到ECTW、ECTH和ECFI,提取各菌株质粒测序验证并保藏菌种。绘制了4株多拷贝tac启动子工程菌生长曲线图并进行了生长活力的相关比较。(4)通过对不同发酵时间酶活力的测定计算出各菌株乙酰酯酶最大酶活力,分别为E.coli RB3好氧发酵(0.367U/m L)、ECON诱导组(40.62 U/m L)、ECTW诱导组(48.65 U/m L)、ECTW非诱导组(28.32 U/m L)、ECTH(3.04 U/m L)和ECFI(35.66U/m L)。最终筛选出产酶能力最强菌株ECTW和发酵周期最短菌株ECFI。(5)提取各菌株总RNA并反转录合成c DNA。以16S r RNA为内参基因进行相对实时定量PCR检测各菌株yba C基因转录水平,结果表明乙酰酯酶酶活力越大的菌株其转录水平也越高,表明不同拷贝tac启动子工程菌乙酰酯酶产量的差异源于yba C基因转录水平的差异。(6)通过离子交换层析法纯化粗酶液乙酰酯酶并分别检测了ECON与ECTW乙酰酯酶的酶学性质,数据汇总后进行了酶学性质比较。ECON与ECTW所分泌乙酰酯酶具有相似的酶学性质,最适温度为51℃,最适p H为8,发挥促进作用的金属离子为Zn2+和Ca2+和Ni2+,其中Ni2+浓度为0.5mmol/L时酶活力最大。