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筛选肽适配子已经成为研究蛋白质功能、鉴定、选取有效新药靶标以及新药研发的重要手段。利用传统的酵母双杂交系统筛选肽适配子技术已经比较成熟,然而该系统由于依赖于转录激活,因此对转录激活因子、胞质蛋白等的研究不能得到应用。传统构建文库的方法耗时费力,构建好的文库只能适用于单一双杂交系统筛选,给肽适配子的筛选造成困难。
本研究基于MAGIC(mating-assisted genetically integrated cloning)的方法发展的新的构建表达文库的方法能将文库基因构建到任何表达载体,实现了文库基因的高通量克隆,同时能保证文库基因的正确表达,为肽适配子的筛选带来方便。其内容主要有以下几个方面:
1.通用型供体载体的构建:通用型供体载体pRKTC上包括R6k复制子、作为同源重组序列的45bp弹性linker、18bp的限制性内切酶I-Sce I识别序列、11bp的限制性内切酶Ear I识别序列、串连终止密码子、TADH终止子(含加尾信号序列)以及氯霉素基因。每一个元件都有着重要作用。
2.载体的验证:利用MAGIC方法得到重组质粒pPC86-prey-21-36,然后将pDBleu-403,pPC86-prey-21-36共同转化Mav203,经显色分析呈阳性。
3.利用环境微生物基因组资源筛选肽适配子:传统的人工合成随机肽库方法筛选肽适配子命中率低。环境微生物基因组资源丰富,编码的天然产物能形成更稳定的构象,因此利用环境微生物基因组资源筛选肽适配子具有一定的研究意义。
4.混合质粒DNA建库筛选肽适配子:本研究将已经共转验证与 pDBleu-403互作的所有猎物质粒DNA混合建库。利用MAGIC方法快速得到了酵母双杂交表达文库pPC86-lib-2。从该文库中成功筛选到了一个与pDBleu-403表达产物互作的猎物质粒pPC86-lib-2/403A,提示可以利用该方法研究靶蛋白互作的亚结构域或结构序列、作用靶点,确定最小的功能单位以及分析抗原的作用表位,绕过传统的构建突变库的繁琐。