目的：　　 研究甲状腺激素受体新亚型TRβ△通过甲状腺激素应答元件(thyroidresponse element，TRE)增强靶基因转录的作用，判断TRβ△是否具有转录因子活性。利用两种突变方式改变TRβ△的DBD(DNA-binding domain，DBD)中P-box的氨基酸序列，分析TRβ△在突变之后是否仍具有与DNA结合后开启转录激活作用的功能。从而阐明保持DBD中P-box氨基酸序列的保守性对于TRβ△受体结合DNA和激活转录的功能的重要性。　　 方法：　　 利用基因重组技术，分别以pETDuet-TRβ1和pETDuet-TRβ△为模板，扩增TRβ1和TRβ△的cDNA插入到载体pcDNA3.1中，构建pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△真核表达载体。设计一对特异引物，利用定向突变技术，将作为TRE类型之一的PAL(palindromic)TRE，即回文序列TRE插入到载体pGL3-Promoter中，构建含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体。将pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△分别与含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体瞬时共转染至COS-7细胞中，并用加有T3的培养基和不加T3的培养基培养细胞后，检测荧光素酶的活性。同时设立pcDNA3.1-TRβ△和pcDNA3.1-TRβ1与不含PAL的pGL3-Promoter共转染及含有PAL的pGL3-Promoter单独转染的对照组。利用定向点突变技术，将pcDNA3.1-TRβ△的DBD中P-box氨基酸序列分别通过突变改换不同的氨基酸。突变后产生的蛋白和其与RXR蛋白杂二聚化后的复合物分别与标记后的DR4进行EMSA实验。突变后的载体分别与含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体瞬时共转染至COS-7细胞中，并用加有T3的培养基和不加T3的培养基培养细胞后，检测荧光素酶的活性。　　 结果：　　 PCR证实成功构建了pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△真核表达载体，测序及酶切结果完全正确。双酶切及测序证实成功构建了含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体。pcDNA3.1-TRβ1和pcDNA3.1-TRβ△分别与含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体瞬时共转染48小时后，可以检测到很强的荧光素酶比活性，而且pcDNA3.1-TRβ1与含有PAL的pGL3-Promoter共转染后用加有T3的培养基培养细胞，同时间点的荧光素酶比活性(RLUs/mg蛋白)比不加T3的培养基培养的细胞升高至16倍，pcDNA3.1-TRβ△与含有PAL的pGL3-Promoter共转染后用加有T3的培养基培养细胞，荧光素酶比活性升高至14倍。测序证实成功构建了pcDNA3.1-TRβ△Amut1突变P-box，将DBD中P-box的第三位氨基酸P突变为G，突变后的P-box的氨基酸序列变为与TRβ1一致的CEGCKG。成功构建了pcDNA3.1-TRβ△mut2突变P-box，将DBD中P-box的氨基酸序列最重要的两个氨基酸EG突变为GA，突变后的P-box的氨基酸序列变为CGACKP。TRβ△mut1蛋白和其与RXR蛋白杂二聚化后的复合物均可与标记后的DR4结合。而TRβ△maut2蛋白自身不能与DR4结合，但RXR可与DR4结合，所以TRβ△mut2蛋白与RXR蛋白杂二聚化后才可与标记后的DR4结合。pcDNA3.1-TRβ△mut1和pcDNA3.1-TRβ△mut2分别与含有PAL的pGL3-Promoter报告基因载体瞬时共转染48小时后，检测荧光素酶比活性，发现前者荧光素酶比活性是后者的7倍，两者同时间点的荧光素酶比活性比不加T3的培养基培养的细胞分别升高至7倍和2.5倍。　　 结论：　　 1.新发现的甲状腺激素受体亚型TRβ△与已发现的TRβ1一样能通过甲状腺激素应答元件增强靶基因转录。　　 2.结果显示报告基因表达水平均可被T3提高。证实TRβ△是一个受配体(T3)诱导的功能性的转录因子。　　 3.新发现的甲状腺激素受体亚型TRβ△的DBD中P-box氨基酸序列与TRβ1的原始DBD中P-box氨基酸序列均与转录激活作用有关，把TRβ△受体的P-box氨基酸序列CEGCKP变为和TRβ1一致的CEGCKG，在其后比TRβ1多30几个氨基酸的情况下仍可通过TRE对报告基因产生转录激活作用，报告基因表达水平均可被T3提高，TRβ△mut1蛋白和其与RXR蛋白杂二聚化后的复合物均可与标记后的DR4结合。但是改变了DBD P-box氨基酸序列中最重要的两个氨基酸，则无法产生转录激活作用，TRβ△mut2蛋白自身不能与DR4结合。说明保持DBD中P-box氨基酸序列的保守性对于TRβ△受体结合DNA和激活转录的功能十分重要。