论文部分内容阅读
目前，NR4A1在调节细胞凋亡中的作用尚有争议。胰腺β细胞中的内质网(ER)经常面临各种不利条件，如高浓度的游离脂肪酸(FFA)和持续的高血糖，而严重的内质网应激导致胰岛β细胞凋亡。本研究的目的是分析NR4A1在内质网应激介导的β细胞凋亡中的作用，并探索相关的机制。我们证实，用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(TG)或棕榈酸(PA)处理MIN6细胞和小鼠胰岛可导致NR4A1的mRNA和蛋白质水平增高。MTT结果表明在MIN6细胞中过表达NR4A1能够抵抗由TG或PA诱导的细胞损失;TUNEL实验结果表明，NR4A1过表达也能防止内质网应激诱导的细胞凋亡。利用siRNA敲出MIN6细胞中NR4A1的表达以及利用NR4A1敲除小鼠进一步证实了上述结论。在MIN6细胞中过表达NR4A1可降低TG或PA引起的C/ EBP同源蛋白(CHOP)的表达和Caspase3的活化。在MIN6细胞和小鼠胰岛中过表达NR4A1可导致SURVIVIN表达的上调。我们证实在SURVIVIN的启动子上（-1872bp至-1866bp）有一个NR4A1的结合位点，免疫共沉淀实验表明，NR4A1与SURVIVIN启动子有物理结合。综上所述，NR4A1通过上调SURVIVIN的表达和下调CHOP的表达来保护胰岛β细胞免受内质网应激介导的细胞凋亡，我们称之为“正向的和负向的调节”。 第一部分 胰岛β细胞中NR4A1与内质网应激的关联 目的:内质网应激诱导剂对NR4A1的表达的影响以及NR4A1对内质网应激引起的β细胞凋亡的作用。 方法: 1.用内质网应激诱导剂TG(0.5μM)或PA(0.4 mM)分别处理MIN6细胞，收取不同时间点样品，提取RNA和蛋白，分别用荧光定量PCR和Western blot检测随TG或PA刺激时间的延长，NR4A1以及内质网应激标志分子CHOP在mRNA和蛋白水平的表达变化。 2.取16周龄的C57BL/6J小鼠，断颈处死，提取并分离纯化小鼠胰岛，将所提取胰岛平均分组，用0.5μM TG或0.4 mM PA分别处理不同时间，提取RNA，用荧光定量PCR法检测内质网应激标志分子BIP，CHOP以及NR4A1的表达变化。 3.取16周龄的C57BL/6J小鼠，断颈处死，提取并分离纯化小鼠胰岛，0.5μM TG或对照溶剂DMSO分别处理6小时，收集胰岛细胞，用胰岛素一抗及NR4A1一抗双染，检测NR4A1在胰岛β细胞中被诱导表达的情况。 4.用过表达NR4A1的慢病毒感染MIN6细胞，建立稳定过表达NR4A1的MIN6细胞克隆，用0.5μM TG或0.4 mM PA分别处理不同时间，用MTT方法检测细胞的存活率;用0.5μM TG或0.4 mM PA处理过表达NR4A1的MIN6细胞及对照细胞24小时，用TUNEL法检测细胞凋亡比率。 结果: 1.用0.5μM TG处理MIN6细胞后，可诱导NR4A1表达升高，其mRNA水平在1小时即有明显升高，2小时达到最高峰，其蛋白水平则逐渐升高，CHOP也明显升高，说明0.5μM TG成功诱导了内质网应激的发生;用0.4 mM PA处理MIN6细胞也可诱导NR4A1表达升高，在16小时达到高峰，同时CHOP也明显升高。 2.分离纯化小鼠胰岛后，用0.5μM TG处理后，NR4A1的mRNA在0.5 h即有明显升高，内质网应激标志分子BIP和CHOP也明显升高;用0.4 mM PA处理后，NR4A1在6小时即有明显升高，CHOP也显著升高。 3.0.5μMTG能诱导NR4A1表达升高（绿色），而DMSO并不能诱导NR4A1表达升高，并且NR4A1大部分与胰岛素（红色）共定位。 4.成功建立稳定过表达NR4A1的MIN6细胞株，过表达NR4A1的细胞称为OV细胞，对照细胞称为NC细胞。MTT结果显示，用0.5μM TG或0.4 mM PA处理后，OV细胞的存活率明显高于NC细胞;TUNEL结果也显示，TG或PA处理后NC细胞的凋亡阳性率明显高于OV细胞。 结论: 1.无论在MIN6细胞还是小鼠胰岛β细胞中，内质网应激诱导剂TG和PA均可诱导NR4A1表达升高。 2.过表达NR4A1可抵抗TG和PA引起的β细胞的凋亡，而沉默或敲除NR4A1后TG和PA更易导致细胞凋亡。 第二部分 NR4A1对UPR反应中各通路的影响 目的:研究NR4A1是通过影响UPR反应中的哪一条信号途径来抵抗内质网应激引起的凋亡。 方法: 1.用0.5μM TG处理稳定过表达NR4A1的MIN6细胞以及对照细胞，收集不同时间点的细胞样品，提取RNA，用荧光定量PCR法检测IRE1通路中sXBP1与tXBP1的比值变化，PERK通路中ATF4的表达变化以及ATF6通路中ATF6的表达变化。 2.用0.5μM TG处理稳定过表达NR4A1的MIN6细胞以及对照细胞，收集不同时间点的细胞样品，提取RNA和蛋白，分别以荧光定量PCR和western blot检测PERK通路中CHOP，eif2α以及其磷酸化形式(P-eif2α)的表达变化。 结果: 1.0.5μM TG处理后，NC和OV细胞在3小时就都发生了XBP1的剪切，但NC和OV细胞中的sXBP1/tXBP1并没有明显差异;而PERK通路中的ATF4在TG处理后都有所提高，但在OV细胞中提高的幅度明显低于NC细胞;而ATF6在两组细胞中也无明显差异。 2.0.5μMTG处理后，NC和OV细胞中的CHOP在mRNA和蛋白水平上均有明显升高，但是在OV细胞的表达要明显低于NC细胞;在TG的作用下，eif2α在两种细胞中并无明显区别，在NC细胞中eif2α持续磷酸化，而在OV细胞中从12小时开始，磷酸化的eif2α发生去磷酸化。 结论: 1.NR4A1对UPR反应中IRE1和ATF6通路无明显影响，但可以通过改变PERK通路中的相应分子的变化来抵抗内质网应激。 2.过表达NR4A1可以使P-eif2α发生去磷酸化，推测NR4A1可能通过改变GADD34来影响eif2α的磷酸化。 第三部分 NR4A1对抗凋亡基因的影响 目的:研究在胰岛β细胞中NR4A1能够调控哪些抗凋亡基因的表达来抵抗内质网应激引起的细胞凋亡。 内容: 1.提取过表达NR4A1的MIN6细胞及对照细胞的RNA和蛋白，荧光定量PCR和westernblot检测NC及OV细胞中抗凋亡相关基因NF-κB，BCL-2，SURVIVIN的表达差异。 2.用过表达NR4A1的腺病毒及对照病毒感染MIN6细胞48小时，收集蛋白样品，westernblot检测NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在蛋白水平上的差异表达。 3.取16周龄的C57BL/6J小鼠，断颈处死，提取并分离纯化小鼠胰岛，用过表达NR4A1的腺病毒及对照腺病毒瞬时感染48小时，提取RNA，以荧光定量PCR检测NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平的差异表达。 结果: 1.在OV细胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA和蛋白水平上的表达都明显高于NC细胞。 2.Ad-NR4A1感染的MIN6细胞中，NR4A1和SURVIVIN的表达都明显高于Ad-GFP感染的MIN6细胞。 3.Ad-NR4A1感染的小鼠胰岛细胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平上的表达都明显高于对照细胞。 结论: NR4A1能够调控抗凋亡基因SURVIVIN，NF-κB及BCL-2的表达，且对SURVIVIN的调控是直接的，而对NF-κB，BCL-2的调控是间接的。