求偶行为是动物交配的必需步骤,对动物的繁衍有着重要意义。fruitless是昆虫求偶行为中的关键基因。在模式昆虫果蝇中,fruitless主要通过调控与求偶相关的神经元形态和数量,从而促使雄性果蝇进行求偶行为。家蚕作为一种重要的鳞翅目模式昆虫,关于fruitless基因研究未见报道。本研究选取了家蚕fruitless基因作为研究对象。首先,对fruitless进行了克隆,序列比对和信息分析,利用RT-PCR分析了其组织和时期表达特征。通过原核表达获得了fruitless的重组蛋白,进一步制备了fruitless的多克隆抗体,然后利用多克隆抗体检测了fruitless在家蚕体内的存在形式,同时进行了亚细胞定位和组织定位;还利用了RNA干涉技术,对家蚕个体进行了干涉实验;最后利用免疫沉淀技术,获得一些潜在的与fruitless相结合的蛋白。主要结果如下:1、家蚕fruitless的克隆、序列分析和表达谱;本研究将果蝇Fruitless蛋白质序列在家蚕数据库Silk DB上进行同源检索,结果发现编号为BGIBMGA006492-TA的预测基因,其定位于家蚕的第6号染色体上。根据预测基因序列设计引物,以家蚕成虫头部c DNA为模板进行基因进行克隆,结果显示,fruitless基因在家蚕中有两种剪切形式,第一种剪切形式含7个外显子,共927 bp;第二种剪切形式含4个外显子,共330 bp(第二种剪切形式在330 bp处,含有终止密码子)。结构域预测结果显示fruitless基因编码蛋白质是含有一个BTB结构域和两个zinc finger结构域的蛋白质。表明fruitless可能作为转录因子发挥作用。RT-PCR结果表明,两种剪接形式在雌雄家蚕的各种组织和蛹期中均有表达。2、家蚕fruitless的原核表达和抗体制备;通过对fruitless的序列分析,设计了表达引物,将目的片段亚克隆到p ET-28a载体上,测序成功后转化到表达菌株Transetta(DE3)内,表达检测发现fruitless的两种剪接形式均以包涵体形式表达。于是进行了蛋白纯化,得到较高纯度的蛋白,送到公司制备得到fruitless的多克隆抗体。抗体特异性检测结果显示,制备的多克隆抗体特异性良好。3、家蚕fruitless的蛋白水平的时空表达分析;利用制备的多克隆抗体,检测到fruitless在家蚕的各个组织中均有表达。而在蛹期fruitless的表达有逐渐增加的趋势。对fruitless蛋白质在细胞中的表达进行了定位,发现fruitless在细胞质中表达。根据fruitless的结构域分析,推测其在个体水平上可能是通过与一些转运因子等的结合,转运到细胞核中进而参与了基因的调控,从而发挥作用。同时也对fruitless在家蚕幼虫的脑中进行了组织定位,发现其主要分布在脑部神经元的周围,和左右两小脑的中间部位的有较高量的表达。4、家蚕fruitless的功能探究;根据家蚕fruitless序列合成双链RNA,在蛹期对家蚕进行干涉,同时,利用定量PCR和Western blot实验对干涉效果进行检测,结果显示个体中fruitless基因下调。通过观察干涉组家蚕和对照组家蚕的求偶行为,发现干涉后的一部分家蚕未能完成交配(在60 min内),而完成交配的家蚕其求偶的时间大多超过10 min。干涉后的家蚕求偶的时间延迟,交配率降低。这些结果说明fruitless在家蚕的求偶行为中发挥着重要作用。5、家蚕Fruitless相互结合蛋白的筛选。通过免疫沉淀实验,找到与对照组差异的蛋白条带。进一步对差异条带进行质谱鉴定,共鉴定出127组,包括327种蛋白。主要分为了4类蛋白,第一类是与神经相关的蛋白,第二类是与细胞周期相关蛋白,第三类是与卵的形成相关蛋白,第四类是功能未知的蛋白。其中,erine/arginine repetitive matrix protein 2,pheromone biosynthesis activating neuropeptide receptor,是与神经相关的蛋白,OVO protein是与卵的形成相关蛋白。这3种蛋白在神经的发育和卵的形成中发挥着功能,可能是与Fruitless相互作用的候选蛋白。下一步我们将通过蛋白质表达和相互结合实验进一步确认它们之间是否具有相互作用。