【研究背景及目的】慢性肝病发展恶化变成肝硬化,需经共同路径-肝纤维化(hepatic fibrosis),在此过程中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)不正常沉积是主要的病理特征。肝纤维化的病理改变具有可逆性和动态性,但是肝硬化不能够发生逆转。所以对于慢性肝病的防治,重点在于明确肝纤维化的发病机制,阻断、抑制及逆转肝纤维化。干细胞在一定的内环境下能够定向分化为类肝细胞,分泌相关细胞因子,促进受损肝脏的修复和再生。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干细胞家族的重要成员,具有低免疫原性和多向分化潜能等特性,是目前研究范围最为广泛的一种成体干细胞。最近几年,骨髓间充质干细胞移植在逆转肝纤维化方面的作用已经得到证实,有望成为肝纤维化治疗的新方法。虽然目前存在研究结果显示,出现组织损伤时多种干细胞会受骨髓的作用移动到发病部位,然后进行自然性、代偿性地修复;但是干细胞移植治疗肝纤维化的疗效仍不确切,其中重要的原因之一是干细胞静脉途径移植后,干细胞很难得到出色的归巢或移行效果,从而影响干细胞的移植治疗,导致疗效较差。因此,要提升干细胞移植的治疗效果,需要进一步提升移植干细胞的“质量”。越来越多的研究把基因治疗的方法和干细胞移植结合起来以提高治疗的精准度。基因治疗是一种新型的治疗手段,它的特点是在靶细胞的染色质基因组内导入正常与野生型的基因,将致病基因置换,或者将缺失基因补偿,最终得到新的表型。RNA干扰(RNA interference,RNAi)的特点是通过内、外源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)进行诱导,使基因沉默在mRNA的水平上产生,它的特异性较强。小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)具有特异性与高效性,现阶段在基因组功能实验的过程中,它被应用的频率较高。siRNA和以前常用的基因抑制工具的不同点在于,sirna对基因表达的抑制水平与效果更好、更持久,稳定性更出色,得到的基因序列具有更高的特异性。rnai这项新型技术可用于特定基因功能的抑制过程中,在生物体特征改善、药品研究、基因治疗及基因组功能研究等方面均可发挥重要的作用。rnai可由慢病毒载体、质粒介导,前者可以感染类型更多样的细胞,获得更出色的沉默效果,得到更高的转染率,并且利用染色体整合使沉默效果更加稳定与持久,所以在基因治疗与基因表达调控等方面,它的应用频率更高。小发卡或短发卡rna(asmallhairpinrnaorshorthairpinrna,shrna)是一段具有紧密发卡环(tighthairpinturn)的rna序列,常被用于rna干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shrna导入细胞,载体中的u6启动子确保shrna总是表达;这种装载了shrna载体可被传递到子代细胞中去,从而使基因的沉默可被遗传。shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna,然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上(rna-inducedsilencingcomplex,risc),该复合物能够结合到目的mrnas并将其降解,起到基因沉默的作用。干细胞之所以能够在循环后在内皮细胞表面黏附,是病变处表达的粘附因子起到了介导作用,接着趋化因子发挥作用,使干细胞通过内皮细胞转移至相关组织内,最后到达病变部位开始分化与增殖过程。各种自然障碍会在干细胞归巢时相遇,例如基底膜与间质结缔组织之间的ecm。干细胞想要通过emc,必须借助于某些酶的作用,这些酶可以对ecm的构成成分进行降解。所以干细胞生成与分泌的蛋白酶类型与机理是干细胞研究的关键。对于ecm的特异性降解,可以发挥作用的酶包括基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶。最近几年的研究结果显示基质金属酶(matrixmetalloproteinase,mmps)能够降解ecm,而体内天然存在的基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmatrixmetalprotease,timps)则可对mmps的活性进行抑制。相关结果显示干细胞穿过基底膜的能力可以通过timp-2、mti-mmp、mmp-2的稳定表达而得到加强,mmp-9不会被干细胞表达,即便被表达,表达量也很低,但是在干细胞的转移与归巢过程中mmp-9发挥了一定的作用。timp-1与timp-2的作用有着显著差异,如果timp-1的表达时间长、表达量高,那么干细胞穿过基底膜的能力会受到抑制,这是因为mmp-9的活性受到了抑制。因此,我们设想通过沉默timp-1,上调mmps的表达增强干细胞穿过基底膜的能力,促进干细胞归巢到纤维化肝脏组织,提高肝纤维化的治疗疗效。本实验在大鼠骨髓间充质干细胞中转染了携带有timp-1-shrna的基因,静脉移植治疗大鼠肝纤维化模型,对转染携带有timp-1-shrna基因的bmscs之后观察肝功能是否得到改善、肝纤维化是否得到抑制,设想是体内增加了骨髓干细胞归巢于纤维化肝脏的数量所致,从而对联合应用rna干扰技术与干细胞移植技术在治疗肝纤维化中的应用前景进行探究,为在更深层次研究干细胞归巢机制打下基础,并进一步探讨干细胞联合rna干扰治疗肝纤维化的机理。【实验方法】1、全骨髓法(贴壁筛选法)进行大鼠bmscs的分离、培养及鉴定大鼠的骨髓mscs分离纯化后,取培养的第二代bmscs,分别加入下列羊抗鼠单克隆抗体:cd34-fitc、cd45-pe、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe、hla-dr-pe,置4℃孵30分钟,pbs洗2次,进行流式细胞仪分析及细胞周期检测;收集培养第三代bmscs,行成骨鉴定等间充质干细胞生物学特性鉴定。2、建立沉默timp-1基因的bmscs稳定转染细胞株。设计、合成3对针对timp-1基因的特异性shrna片段,在293t细胞中转染测序准确的慢病毒与载体质粒包装得到的质粒,收集、纯化和浓缩富含慢病毒的细胞上清液。使用慢病毒包装系统来沉默具有timp-1基因不同位点的3组骨髓间充质干细胞株(sh1、sh2、sh3组),同时设立转染空载体组,对每组细胞转染先后细胞形态与荧光的表达量进行观测。再抽提蛋白,通过westernblot技术对timp-1蛋白的表达量进行检测。3、制备ccl4损伤大鼠肝纤维化模型本课题组随机将40只sd大鼠40只,体重200-300g,雄性大鼠,分为模型组(n=36)和正常对照组(n=4),模型组腹腔注射ccl4(1μl/g,橄榄油1:1稀释),正常对照组腹腔注射等体积生理盐水,每周2次,连续4周,制备大鼠肝纤维化模型。4、静脉注射转染基因治疗大鼠肝纤维化肝纤维化模型组第5周随机分为3组,每组12只,bmscs组(通过鼠尾静脉注射3×106个大鼠bmscs细胞),timp-1-shrna-bmscs组(通过鼠尾静脉注射3×106个携带timp-1-shrna病毒载体感染的大鼠bmscs细胞),空白组(通过鼠尾静脉注射生理盐水200μl)。在4周移植之后将全部实验动物处死:将实验组肝脏提取出来进行冰冻切片,gfp标记阳性表达细胞在肝内的分布通过荧光显微镜观察;取各组大鼠肝脏做石蜡切片,he染色检测肝纤维化情况;免疫组织化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在移植前后肝脏中的表达;肝功能指标检查:将全部动物的血清回收,通过全自动生化仪进行观测,分析ast、alt等肝功指标的情况,从而评价转染timp-1-shrna的bmscs治疗大鼠肝纤维化的效果。【实验结果】1、全骨髓法(贴壁筛选法)进行大鼠bmscs的分离、培养及鉴定原代培养7天的大鼠bmscs贴壁生长,折光性强,细胞呈梭形、三角形和多角形。2周时细胞生长可达80%融合,细胞为大梭形,排列紧密并有一定的方向性,呈成纤维细胞样分布。传代培养后细胞生长速度明显加快,接种3小时后即可出现贴壁。传代培养3天后逐渐形成扁平单层细胞,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞。第5天可达到90%融合,细胞形态呈相对均匀一致的长梭形且胞浆丰富、折光度好,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞。流式细胞仪检测显示,bmscs表达cd90、cd73、cd105和cd166,不表达cd34、cd45、cd14、cd106和hla-dr。流式细胞仪结果显示,第2代mscs中g0/g1期的细胞为94.1%,g2期的细胞为4.9%,s期的细胞为1.0%,大部分细胞处于静止期,只有少数的细胞处于活跃的增殖期符合干细胞特征。细胞生物学特性检测,具有成骨细胞、成脂细胞及软骨细胞的多向分化潜能,符合骨髓间充质干细胞生物学特性。2.建立沉默timp-1基因的bmscs稳定转染细胞株。慢病毒转染bmscs1周后,每组内均被观察到强荧光,转染前后细胞形态无改变。免疫印迹技术分析蛋白表达,结果表明在3个实验组中,sh3组timp-1蛋白表达最低。3、制备ccl4损伤大鼠肝纤维化模型肝组织苏木精-伊红染色显示:正常大鼠肝小叶结构清晰,无炎症坏死及纤维化;ccl4注射4周可见纤维结缔组织大量增生,形成广泛纤维间隔伴有小叶结构紊乱,假小叶形成。4、静脉注射转染基因治疗大鼠肝纤维化组织学检测结果:肝组织切片中,空白组大鼠肝内胶原纤维在汇管区和中央静脉区增生明显,并向肝实质内延伸,相互联接形成假小叶;实验组大鼠肝脏内部纤维化水平减轻显著,虽然仍有假小叶,但是小叶四周与内部的胶原纤维量显著降低,肝小叶形态基本正常,肝细胞外基质(ecm)排列与正常相似;对照组介于两者之间。免疫组化检测结果:正常组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原主要分布在汇管区,呈褐色,阳性染色区域少;移植4周后对照组Ⅰ、Ⅲ胶原染色显示褐色区域穿插在脂肪变性细胞间,树枝状分布,染色区域明显增多;timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ、Ⅲ胶原染色仍在脂肪变性区域,但褐色区域明显减少;bmscs组Ⅰ、Ⅲ胶原染色区域在对照组和实验组间。免疫组化半定量分析结果:正常组和对照组、bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值分别为0.8899、0.6883、0.3912(p均<0.01);对照组和bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值分别为0.2017、0.4988(p均<0.01);bmscs组和timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值为0.2971(p<0.01)。正常组和对照组、bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值分别为0.79853、0.5978、0.3993(p均<0.01);对照组和bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值分别为0.1874、0.3859(p均<0.01);bmscs组和timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值为0.1985(p<0.01)。经移植治疗后,timp-1-shrna-bmscs组胶原含量明显减少,纤维化程度减轻。血清学检测结果:全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功能指标显示:timp-1-shrna-bmscs组、bmscs组和对照组alt、ast水平均显著高于正常对照组(p<0.01),timp-1-shrna-bmscs组和bmscs组alt、ast水平低于对照组(p<0.05),timp-1-shrna-bmscs组alt下降明显((p<0.01))。【结论】1、通过mscs贴壁性质,在体外环境下成功分离、培养和扩增了大鼠骨髓mscs,鉴定符合bmscs的生物学特性,为进一步行干细胞研究奠定基础。2、设计并成功地合成了3组沉默大鼠timp-1基因的短发夹rna,通过慢病毒包装系统成功构建沉默timp-1基因的3组骨髓间充质干细胞株,而且在3组细胞株中成功筛选出沉默TIMP-1基因效率最高的细胞株。3、成功建立CCl4损伤大鼠肝纤维化模型,用于肝纤维化基础及临床研究。4、移植沉默TIMP-1-shRNA基因的BMSCs,比单纯BMSCs移植更能改善肝脏功能,减少ECM在肝脏异常沉积及减轻肝纤维化程度。可能成为治疗肝纤维化的新方法。