人脑胶质瘤(glioma)是最常见的脑源性肿瘤。其中的胶质母细胞瘤是恶性程度最高预后最差的一种亚型。胶质母细胞瘤病人的平均生存期即使在经过手术治疗的情况下也仅有16个月。手术、化疗以及放疗等常规治疗目前未能取得理想的治疗效果。造成常规治疗效果较差的主要原因是由于肿瘤的异质性以及特殊的胶质瘤免疫微环境。胶质瘤免疫微环境由多种肿瘤相关免疫细胞组成,其中包括肿瘤相关巨噬细胞,髓系免疫抑制细胞以及肿瘤相关淋巴细胞等。胶质瘤诱导而成的特殊免疫环境不仅可以抑制肿瘤局部的免疫功能,还可以抑制全身的免疫系统。诱导特异性胶质瘤免疫微环境的一个最重要的物理因素是胶质瘤的低氧物理环境。与其他的实体肿瘤类似,胶质瘤瘤体内部存在明显的低氧,WHOIV级胶质瘤的氧分压低于1%,III级胶质瘤的氧分压也仅有2.5%-10%。这种强烈的低氧环境影响着胶质瘤细胞的增殖以及其免疫微环境中免疫细胞的特性。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)是肿瘤内部特征性的一群单核细胞来源的巨噬细胞。它们在促进肿瘤进展和抑制正常免疫系统过程中起重要作用。肿瘤相关巨噬细胞进一步可以被分为两种亚型,也就是M1与M2亚型。M2亚型的肿瘤相关巨噬细胞有特异性的分子标志,包括CD163,CD206,IL-10,IL-1ra以及CCL-22等。该亚群细胞能够通过分泌免疫抑制性细胞因子抑制正常免疫功能进而促进肿瘤进展,而且它们也与胶质瘤的抗化疗药物特性相关。有研究表明,肿瘤低氧环境可以影响肿瘤相关巨噬细胞的特性以及促进其在低氧区域的募集。因此,研究肿瘤相关巨噬细胞如何被募集至胶质瘤,如何极化至M2亚型以及低氧在这个过程中的作用机制至关重要。髓系免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressive cells,MDSC)是肿瘤免疫微环境中的另一种重要细胞。它们不但可以在胶质瘤局部抑制正常肿瘤免疫功能,还可以通过血液以及淋巴系统在外周循环并抑制外周免疫系统。MDSC在人体中有特异性的CD11b+CD33+HLA-DR-分子表型,而在小鼠体内有Gr-1+CD11b+表型。由于髓系免疫抑制细胞起源自骨髓,它的分化在外周免疫系统已经开始。因此,胶质瘤必定通过某种远距离的作用方式,在外周促进髓系免疫抑制细胞的分化与增殖。外泌体(exosome)是细胞分泌的一种直径介于50-150 nm的囊泡。研究表明肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过向免疫细胞传递小RNA(miRNA)进而改变免疫细胞的生理特性。miRNA是长度在19到25个核苷酸的单链非编码RNA,他们可以在转录后水平与靶基因的3’非翻译区(3’UTR)通过互补序列结合,进而造成靶基因降解或者抑制其翻译。它们在免疫细胞的成熟与分化中起重要作用。中枢神经系统肿瘤来源的外泌体可以穿过血脑屏障进入血液循环,进而达到由局部肿瘤细胞分泌而向远处靶细胞传递miRNA的效果。研究表明,低氧可以改变肿瘤细胞外泌体的成分,但是相关研究在胶质瘤中还未进行。低氧是否可以通过改变胶质瘤细胞外泌体进而促进病人体内髓系免疫抑制细胞的增殖与功能引起了我们的兴趣。本课题以胶质瘤特征性的低氧微环境为出发点,深入研究了低氧对胶质母细胞瘤内不同免疫细胞的影响。首先我们通过体内与体外实验,发现了胶质瘤的低氧区域富集了大量M2型免疫抑制肿瘤相关巨噬细胞,且进一步发现低氧通过上调胶质瘤细胞分泌的POSTN募集肿瘤相关巨噬细胞至低氧区。同时,低氧可以通过上调M-CSFR和TGF-β的表达而促进肿瘤相关巨噬细胞分化至M2亚型。其次,我们发现药物Acriflavine(ACF)可以通过抑制上述通路降低胶质瘤内M2型巨噬细胞的聚集,抑制胶质瘤生长。此外,本研究还通过针对低氧刺激的胶质瘤外泌体的miRNA测序分析,发现了低氧诱导上调的外泌体miR-10a与miR-21可以促进髓系免疫抑制细胞的增殖与免疫抑制功能。本文针对低氧在促进胶质母细胞瘤抑制性免疫微环境的形成的作用中,以肿瘤相关巨噬细胞与髓系免疫抑制细胞为切入点,进行了深入研究,并为人脑胶质母细胞瘤的免疫治疗提供了多个潜在的基因与分子靶点,在胶质瘤免疫治疗的理论与应用方面有重要价值。第一部分 低氧促进胶质瘤相关巨噬细胞的聚集和M2极化的现象以及机制研究1.1目的:(1)探究人脑胶质母细胞瘤低氧微环境如何影响肿瘤相关巨噬细胞的聚集与M2极化。(2)探究人脑胶质母细胞瘤中低氧诱导肿瘤相关巨噬细胞的聚集与M2极化背后的分子机制。(3)寻找一种可以针对低氧诱导M2型肿瘤相关巨噬细胞聚集关键分子的抗胶质瘤药物,检验其是否可以通过降低M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸以抑制胶质瘤生长。1.2材料与方法:(1)不同级别人脑胶质瘤组织以及小鼠胶质瘤组织的免疫组化与免疫荧光检测。利用免疫组化及免疫荧光,对不同级别胶质瘤标本及小鼠胶质瘤组织中低氧(HIF-1a)的分布、M2型肿瘤相关巨噬细胞(CD206、CD11b)的分布、POSTN的表达,以及肿瘤细胞中HIF-1a与POSTN的共定位进行研究。(2)POSTN与胶质瘤细胞培养上清对肿瘤相关巨噬细胞的趋化实验。通过运用Transwells小室迁移实验,分别研究POSTN蛋白以及低氧诱导刺激的U87与U251两种胶质瘤细胞培养上清对肿瘤相关巨噬细胞的趋化作用。(3)使用单核细胞株与人外周血单核细胞,研究低氧物理环境与低氧诱导的肿瘤细胞上清对肿瘤相关巨噬细胞的M2极化作用。分别通过低氧物理环境与收集的低氧刺激的肿瘤细胞分泌的上清,对THP-1单核细胞株以及人外周血单核细胞进行刺激。随后,利用形态学分析、流式细胞技术、荧光实时定量PCR与酶联免疫吸附测定的方法,研究这两种低氧刺激对肿瘤相关巨噬细胞向M2型分化的诱导作用。(4)低氧诱导肿瘤相关巨噬细胞的聚集与M2极化的分子通路研究。对U251和U87人胶质瘤细胞系、人外周血单核细胞诱导的巨噬细胞以及THP-1细胞系诱导的巨噬细胞,进行转染、细胞因子刺激或者通路抑制剂处理后,分别提取总RNA和总蛋白,使用q-PCR和Western blot技术检测上述细胞内相关mRNA和蛋白分子的表达水平,研究低氧诱导巨噬细胞的聚集与M2极化的分子通路。(5)胶质瘤细胞在小鼠颅内的成瘤研究。利用立体定向仪,将U87胶质瘤细胞注射入裸鼠颅内,同时对不同实验组进行不同剂量的HIF-1α阻断剂Acriflavine的注射。6周后,利用核磁共振以及免疫组化的方式,研究Acriflavine对颅内肿瘤的大小、HIF-1α的表达以及肿瘤相关巨噬细胞聚集的影响。1.3结果:(1)胶质瘤低氧区域有更高的M2型肿瘤相关巨噬细胞的聚集与POSTN表达。通过对不同级别人脑胶质瘤组织的免疫组化与免疫荧光分析,以低氧诱导因子(HIF-1α)表达为低氧区域的标志,我们发现随着胶质瘤级别升高,肿瘤低氧区域与密度逐渐升高,且POSTN分子表达与M2型肿瘤相关巨噬细胞主要分布在低氧区域。同时,在这些胶质瘤患者中,高POSTN表达与高M2型肿瘤相关巨噬细胞的聚集都预示着更差的预后。(2)低氧刺激促进胶质瘤细胞分泌POSTN,进而趋化肿瘤相关巨噬细胞至低氧区域。通过免疫荧光染色,发现表达低氧诱导因子(HIF-1α)的肿瘤细胞同时也表达POSTN分子。我们进一步用Western blot在U87与U251两个胶质瘤细胞系中验证了低氧HIF-1α/TGF-α/RTK/PI3-K通路上调POSTN的表达。在利用常氧/低氧刺激的胶质瘤细胞培养上清对巨噬细胞的趋化实验中,我们发现低氧刺激的胶质瘤细胞上清有更强的对巨噬细胞的吸引能力,低氧肿瘤上清中的POSTN是吸引肿瘤相关巨噬细胞的重要分子。(3)低氧通过上调肿瘤相关巨噬细胞M-CSFR的表达以及促进胶质瘤细胞分泌TGF-β两种途径,促进肿瘤相关巨噬细胞的M2极化。利用巨噬细胞的形态(长梭形为M2型巨噬细胞,卵圆形为M1型巨噬细胞),表面分子标志(CD163为M2型巨噬细胞),分泌的细胞因子特征(IL-10与CCL-22为M2型巨噬细胞特征细胞因子)以及基因表达特征等指标,发现低氧可以通过两种途径促进肿瘤相关巨噬细胞M2极化:首先,低氧上调巨噬细胞M-CSFR表达进而直接促进肿瘤相关巨噬细胞的M2极化;其次,低氧可以通过上调胶质瘤细胞分泌的TGF-β进而促进肿瘤相关巨噬细胞的M2极化。(4)低氧诱导因子(HIF-1α)抑制剂ACF可以抑制低氧诱导的M2型肿瘤相关巨噬细胞在胶质瘤内浸润并且抑制小鼠颅内种植胶质瘤的生长。ACF可以抑制低氧对胶质瘤相关巨噬细胞的聚集和M2极化作用。它抑制上述现象的分子机制是:ACF通过抑制HIF-1α这一关键分子,进而抑制低氧诱导的胶质瘤细胞POSTN与TGF-β的表达以及抑制肿瘤相关巨噬细胞M-CSFR的表达。同时我们发现,ACF对小鼠颅内种植胶质瘤生长具有抑制作用。1.4结论:低氧微环境可以从多个方面促进M2型肿瘤相关巨噬细胞在胶质瘤内的聚集。首先低氧可以通过HIF-1α/TGF-α/RTK/PI3-K通路促进胶质瘤细胞分泌POSTN,进而趋化肿瘤相关巨噬细胞至低氧区域。其次,低氧可以通过上调肿瘤相关巨噬细胞表面的M-CSFR表达,以及上调胶质瘤细胞分泌TGF-β,促进肿瘤相关巨噬细胞的M2极化。ACF作为一种HIF-1α抑制剂,可以通过抑制低氧诱导的POSTN、M-CSFR与TGF-β的表达,抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在胶质瘤内的聚集,进而抑制肿瘤的进展。第二部分低氧通过促进胶质瘤细胞外泌体传递miR-10a与miR-21促进髄系免疫抑制细胞的增殖及免疫抑制功能2.1目的:(1)探究低氧对胶质瘤外泌体的形态与数量的影响。(2)通过miRNA测序,探究低氧对胶质瘤外泌体中miRNA成分的影响。(3)探究常氧及低氧胶质瘤外泌体对髓系免疫抑制细胞增殖与功能的影响。(4)探寻低氧胶质瘤外泌体促进髓系免疫抑制细胞增殖与功能的分子机制。2.2材料与方法:(1)胶质瘤细胞外泌体的提取与鉴定利用超速梯度离心法,提取常氧及低氧胶质瘤细胞外泌体,并利用电子显微镜、Nanosight及Western blot对外泌体的数量、直径以及分子标志进行分析。(2)髄系免疫抑制细胞对外泌体的摄取实验首先利用PKH-67对胶质瘤外泌体进行荧光标记,随后通过将荧光外泌体与髓系免疫抑制细胞体外共培养以及将荧光外泌体体内注射的实验,利用共聚焦显微镜与流式细胞仪检测髓系免疫抑制细胞是否可以摄取外泌体。(3)胶质瘤细胞外泌体在体外与体内环境诱导髓系免疫抑制细胞的实验通过在体外使用不同胶质瘤外泌体刺激小鼠骨髓细胞的方式以及在小鼠体内通过尾静脉注射不同胶质瘤外泌体(常氧或低氧刺激产生的外泌体)的方式,检验胶质瘤外泌体对髓系免疫抑制细胞的分化与免疫抑制功能的促进作用。利用流式细胞技术检测Gr-1+CD11b+阳性细胞的方法检测髓系免疫抑制细胞分化比例。利用CFSE细胞增殖检测试剂盒、ELISA试剂盒(IL-10与TGF-β)、ROS检测试剂盒、精氨酸酶检测试剂盒与一氧化氮检测试剂,检测外泌体对髓系免疫抑制细胞的免疫抑制功能的诱导作用。(4)针对常氧及低氧胶质瘤细胞外泌体进行miRNA测序与关键分子的筛选利用HiSeq2500仪器,对常氧低氧胶质瘤外泌体进行miRNA测序与分析。利用转染的方法对表达前20位的miRNA向小鼠骨髓细胞瞬时转染,随后用流式细胞技术检测髓系免疫抑制细胞的活化水平,寻找促进髓系免疫抑制细胞增殖与功能的关键miRNA分子。(5)miRNA-10a与miRNA-21下游调控靶点预测以及荧光素酶报告基因实验使用miRNA耙基因数据库(例如:targetscan)筛选出miRNA-10a与miRNA-21可能直接作用的髓系免疫抑制细胞相关靶基因。通过q-PCR确认miRNA-10a与miRNA-21过表达后预测的靶基因表达水平的下调。随后分别对髓系免疫抑制细胞进行miRNA-10a或miRNA-21 mimics与含有靶基因野生型或突变型结合位点的荧光素酶报告基因质粒共转染后,进行双荧光素酶报告基因实验以确定miRNA-10a与miRNA-21直接作用的靶基因。(6)miRNA-10a与miRNA-21下游分子通路研究。对髓系免疫抑制细胞进行特定的处理,并分别提取总RNA和总蛋白,使用q-PCR和Western blot技术检测上述细胞内相关mRNA和蛋白分子的表达水平以研究miRNA-10a与miRNA-21下游分子通路。(7)敲除miRNA-10a或miRNA-21的胶质瘤细胞在小鼠颅内成瘤实验利用慢病毒转染的方式,敲除GL261小鼠胶质瘤细胞系中的miR-10a或者miR-21后,利用立体定向仪,将该细胞系进行小鼠颅内原位成瘤实验,随后利用MRI、流式细胞技术、ROS检测试剂盒、精氨酸酶检测试剂盒与一氧化氮检测试剂盒对miRNA敲除的胶质瘤细胞所形成的肿瘤对小鼠体内髓系抑制细胞增殖与功能的影响进行检测。2.3结果:(1)体内体外实验证实胶质瘤细胞分泌的外泌体可以被髄系免疫抑制性细胞吞噬。利用超速离心机,通过梯度离心的方法,通过电子显微镜与Nanosight仪器观察,我们提取出高纯度的直径约1OOnm,表达TSG101与CD9的胶质瘤细胞外泌体。我们通过使用PKH67对胶质瘤细胞分泌的外泌体进行染色,随后将其与髓系免疫抑制性细胞进行体外共培养或将其对小鼠进行尾静脉注射后,利用共聚焦显微镜与流式细胞仪对髓系免疫抑制性细胞进行观察,发现被染色的外泌体被髓系免疫抑制性细胞摄取。(2)低氧通过上调胶质瘤外泌体中miRNA-10a与miRNA-21的表达,促进髄系免疫抑制性细胞的增殖与功能。通过将常氧与低氧胶质瘤外泌体在体外与骨髓细胞共培养或者通过尾静脉注射的方式注入小鼠体内,我们发现低氧诱导的胶质瘤细胞外泌体有更强的促进髓系免疫抑制性细胞(CD11b+Gr-1+)增殖的作用;同时它对髓系免疫抑制性细胞的免疫抑制功能如抑制淋巴细胞增殖,促进ROS表达,促进NO分泌与增强Arginase功能也有更强的作用。通过对低氧/常氧诱导胶质瘤细胞的外泌体进行miRNA测序,我们筛选出低氧胶质瘤外泌体内表达前20位的miRNA,随后通过对小鼠骨髓细胞转染的方式进行筛选,发现miRNA-10a与miRNA-21对髓系免疫抑制性细胞有最强的促进作用。若对低氧胶质瘤外泌体进行miRNA-10a或miRNA-21敲除,我们观察到低氧胶质瘤细胞外泌体原有的对髓系免疫抑制性细胞的强促进作用消失了。(3)miRNA-10a或miRNA-21敲除的胶质瘤细胞在小鼠颅内成瘤后对髄系免疫抑制性细胞的刺激作用减弱。我们通过慢病毒转染的方法,对GL261小鼠胶质瘤细胞系进行miRNA-10a或miRNA-21敲除,随后通过颅内原位成瘤的方式注入小鼠脑内。我们发现相比于对照组,miRNA-10a或miRNA-21敲除胶质瘤对髓系免疫抑制性细胞的促进作用明显降低。(4)miRNA-10a/R0RA/Iκ B α/NF-κ B 及 miRNA-21/PTEN/PI3K/AKT 通路为低氧胶质瘤外泌体促进髓系免疫抑制性细胞作用的关键通路。通过荧光素酶报告基因、慢病毒转染、q-PCR与Western blot的方法,我们发现 miRNA-1 0a/RORA/IκBα/NF-κB 及 miRNA-21/PTEN/PI3K/AKT 通路为低氧胶质瘤外泌体在体外与小鼠体内有更强的促进髓系免疫抑制性细胞作用的关键通路。2.4结论:上述研究发现,胶质瘤低氧可以通过促进胶质瘤细胞分泌外泌体与上调外泌体中miRNA-10a与miRNA-21的方式,促进髓系免疫抑制性细胞的增殖与免疫抑制功能。该过程主要通过miRNA-1 Oa/RORA/IκBα/NF-κB及miRNA-21/PTEN/PI3K/AKT的分子通路实现。