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脊椎数是猪重要经济性状,影响猪胴体长、单位产肉量及乳头数。本实验室及日本Mikawa研究小组利用一系列的遗传学分析在7号染色体（SSC7）上鉴别一个显著影响猪脊椎数的数量性状位点（QTL）,该位点的单个等位基因可使胸椎数（TVN）增加0.5,vertnin（VRTN）被认为是该位点的候选因果基因,且该基因上的两个突变位点被鉴定为候选因果突变位点（QTNs）,它们很可能起源于中国地方猪并在历史上被导入到欧洲猪中。本研究旨在前期工作基础上对VRTN基因进行深入的功能验证,解析猪胸椎数变异的分子机理。本研究首先使用60K SNP芯片判定了609头杜长大杂交猪39,367个SNP的基因型,与胸椎数进行全基因组关联分析（GWAS）,发现最强关联位点是位于SSC7上的MARC0038565(P=1.87×10-51),通过连锁不平衡分析确定了400 kb的QTL置信区间。在置信区间内增加分子标记密度后,再次开展GWAS分析,结果发现VRTN基因中的g.8063G>A、g.13066C>T、g.19034A>C和g.2031120312ins291四个SNP与胸椎数关联性最强(P=5.79×10-62),解释了杜长大群体胸椎数68.7%的表型变异;QTL置信区间进一步缩小至100 kb,该区间仅存在一个基因,即VRTN,由此证实了VRTN是SSC7上影响胸椎数的因果基因。接着,采集了C57小鼠5.5-12.5天（dpc）胚胎,使用Trizol法提取RNA,通过qPCR测定VRTN在不同胚胎发育期的表达量,发现VRTN基因在胚胎体节发育时期（7.5-9.5 dpc）高量表达,该时期正是胸部体节的形成阶段。因此,VRTN的时空表达特征支持该基因是调控胸椎数的因果基因。为了鉴别VRTN的因果突变位点,本研究构建了上述VRTN基因中4个与胸椎数最强关联SNP的野生型及突变型荧光酶素报告质粒,通过荧光报告检测发现g.19034A>C和g.2031120312ins291的突变型等位基因可上调靶基因的表达且具有加性效应。为了模拟两个候选因果突变点的加性增强效应,将g.2031120312位点的291bp插入突变的两个拷贝片段连入LacZ质粒,制备LacZ转基因小鼠。取9.5天鼠胚进行LacZ染色,发现双拷贝291bp片段可特异性在头部,心脏,体轴后端、新形成的体节及前体节中胚层（PSM）前端上调LacZ基因的表达。此外,VRTN基因在猪胸部体节形成时期沿前后体轴的表达从头到尾逐渐减弱,且17.5胚龄（胸部体节形成时期）g.19034A>C和g.2031120312ins291两位点纯合突变型（QQ）个体的VRTN mRNA及蛋白表达量均显著高于野生型（qq）个体。这些结果支持VRTNg.19034A>C和g.2031120312ins291是调控胸椎数的因果突变位点。本研究随后开展了细胞核定位实验、荧光漂白恢复实验、免疫共沉淀测序（ChIP-seq）以及VRTN过表达实验等,证明了VRTN定位于细胞核中,在全基因组范围内与DNA特定序列相结合并调节相关基因的转录,是一种新的转录因子。为了进一步探究VRTN基因在胸椎发育过程中的功能,本研究采用Talen技术获得了Vrtn基因敲除小鼠。Vrtn纯合敲除鼠胚在9.5 dpc和10.5 dpc的体轴翻转失败,体节数少于13个,且形态不规则排列混乱,在11.5日龄消化殆尽。此外,一半以上Vrtn杂合敲除成年小鼠脊椎发育异常;与野生型小鼠相比,其肋骨数减少一对或单侧减少一根。这些结果进一步支持VRTN是调控胸椎数的因果基因,是体节发育阶段必不可少的转录调控因子。为了深入解析VRTN调控胸椎数的分子机理,本研究采集了17.5日龄的VRTN QTN纯合突变型及野生型猪胚胎,开展RNA测序（RNA-seq）,通过对比分析,在这两类样品间共筛选到42个差异表达基因（DEGs）,其中NOTCH2和HSPG2基因与体节形成密切相关。GO和KEGG分析揭示前20个DEGs最显著富集的通路包括Notch及Dorso-Ventral axis formation两个体轴发育相关的通路。NOTCH2位于Notch通路,与Notch-Delta的偶联相关,且与VRTN的表达部位及表达时期具有一致性。Notch信号通路是体节发育的重要通路,是时钟波峰模型的主要组成部分。为此,选取NOTCH2基因为研究对象,利用Realtime PCR验证了RNA-seq实验结果的可靠性。为了确定VRTN与Notch信号通路的关系,构建了Notch通路下游HES1基因荧光报告质粒,与VRTN共转猪PK-15细胞系,通过荧光信号检测发现VRTN基因可上调HES1的表达,即调控Notch信号通路。已有研究表明,体节分节周期加快会使小鼠出现更多但更短的体节,这与本研究在304头杜长大商品猪中观测到的结果相符合,VRTN QTNs纯合突变型个体的胸椎数较野生型个体增多一根,胸椎总长增加半根椎骨长度。综合本研究的实验结果,我们提出一个VRTN调节胸椎数的分子机理假设模型:在猪胚体节发育时期,VRTN QTNs突变型等位基因特异性上调PSM部前端VRTN基因的表达量,使得该区域NOTCH2的表达上调;NOTCH2的上调增强了PSM内细胞间Notch-Delta的偶联速率,加快了Notch通路信号转导,使相邻细胞间同步化速率加快,改变分节时钟周期与胚胎发育速率之间的平衡,导致体节数量增多,单根体节长度变短,最终胸椎数量增多,单根椎骨长度变短,胸椎总长增加半根椎骨长度。综上所述,本研究通过一系列分析证实了VRTN是SSC7上影响胸椎数的因果基因,VRTN g.19034A>C和g.2031120312ins291是影响胸椎数的因果突变位点,并揭示VRTN可能通过Notch信号通路调控胸椎数。本研究不仅为利用基于VRTN QTN的分子育种改良猪肉产量提供了强有力的理论支持,也为人类脊椎相关疾病研究提供新的视角和借鉴。