【摘 要】
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[目的]前期microRNA芯片分析获得大鼠全横断脊髓损伤后表达变化有意义的nicroRNA,本实验选择其中的miR-31进一步筛查其在神经系统调控的靶基因,研究miR-31在体外实验中对相关靶基因mRNA的调控并分析其作用机制,从而为脊髓损伤后miR-31的调控机制提供重要依据。[方法]在前期microRNA芯片实验中,筛选出大鼠全横断脊髓有意义差异表达的microRNAs,本实验选取其中的mi
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[目的]前期microRNA芯片分析获得大鼠全横断脊髓损伤后表达变化有意义的nicroRNA,本实验选择其中的miR-31进一步筛查其在神经系统调控的靶基因,研究miR-31在体外实验中对相关靶基因mRNA的调控并分析其作用机制,从而为脊髓损伤后miR-31的调控机制提供重要依据。[方法]在前期microRNA芯片实验中,筛选出大鼠全横断脊髓有意义差异表达的microRNAs,本实验选取其中的miR-31,利用生物信息学预测miR-31的靶基因并结合本实验室前期利用相同的动物模型筛查出的差异表达蛋白以及文献报道与神经系统相关的因子,作为候选靶分子进行筛选。然后将miR-31体外转染PC12细胞（PC12细胞分为正常细胞组,单纯脂质体转染组和miR-31转染组）,研究miR-31对培养细胞形态学,数量和活力的影响。使用RT-PCR技术从mRNA水平搜寻miR-31调控的靶基因,使用免疫细胞化学结合图像分析技术确定靶分子蛋白水平,从而最终确定miR-31调控的靶分子。所得数据采用单因素方差分析进行统计。[结果]1、利用生物信息学预测miR-31的靶基因,结合RT-PCR技术最终选定6个可能的靶基因,分别是真核翻译起始因子5 （eukaryotic translation initiation factor 5, EIF5）,泛素羧基末端水解酶1（BRCA1 associated protein-1 （ubiquitin carboxy-terminal hydrolase）, BAP1）,突触融合蛋白（syntaxin 12, STX12）,小囊泡联合膜蛋白相关蛋白B和C（VAMP（vesicle-associated membrane protein）-associated protein B and C, VAPB）,钙依赖电压门控通道-p亚单位（Calciumchannel,voltage-dependent, beta 2 subunit, CACNB2）, G蛋白信号系统4调节体（regulator of G-protein signalling 4, RGS4）作为候选靶因子。2、用miR-31：脂质体=1：20为最适浓度为转染PC12细胞,结果发现miR-31转染导致PC12细胞数目减少,而MTT显示转染前后细胞活力和形态无明显变化。表明miR-31明显抑制PC12细胞增殖。3、RT-RCR检测PC12细胞中靶因子mRNA的表达情况。其中CACNB2, RGS4没有检测到mRNA表达；EIF5, BAP1, STX12, VAPB均检测到mRNA表达,正常组同单纯脂质体转染组比较均无统计学差异；而miR-31转染组EIF5 mRNA （P=0.048,P<0.05）, BAP 1 mRNA （P=0.008, P<0.01）,均明显增加,有统计学差异；比较之,miR31转染组STX12mRNA表达水平较单纯脂质体转染组明显降低（P=0.007,P<0.01）,有统计学差异。而miR-31转染组VAPB mRNA表达水平较单纯脂质体转染组无统计学意义的变化。4、免疫组织化学检测：正常脊髓中EIF-5、BAP1阳性表达。EIF-5免疫阳性产物分布于神经元和胶质细胞的胞浆。BAP1着色较浅主要分布于神经元,尤其是后角的神经元；免疫细胞化学染色显示：EIF-5、BAP1在PC12细胞有表达,阳性反应物定位于细胞浆。然而miR-31转染组同脂质体组光密度值分析均无统计学差异。[结论]1、用PC12细胞株实验证明,miR-31能够诱导PC12细胞凋亡,而且STX12是miR-31的直接靶因子；即miR-31从mRNA水平直接下调STX12表达。2、miR-31还可能通过间接方式引起BAP1, EIF5 mRNA水平上调；机制不清。3、本实验未检测到miR-31对VAPBmRNA调控。
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