桔小实蝇Bactrocera dorsalis是一种重要的农业害虫,由于寄主范围广、适应能力强、繁殖速度快等特点,导致其在田间对包括马拉硫磷在内的多种杀虫剂产生了抗药性。虽然已有研究发现,解毒代谢酶基因上调表达在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性中具有一定的作用,但尚不清楚是否有其它抗性机制在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性形成中发挥作用。穿透抗性通过改变昆虫表皮结构和成分使杀虫剂穿透受阻,降低昆虫对杀虫剂的敏感性,是田间害虫交互抗性形成的原因之一。明确桔小实蝇对马拉硫磷是否存在穿透抗性及其分子机制,有助于延长杀虫剂的使用寿命,降低对桔小实蝇的防治成本。据此,本学位论文基于室内桔小实蝇马拉硫磷敏感品系和经连续多代筛选获得的抗性品系,通过透射电镜、高效液相色谱和不同施药方式等技术和手段,发现桔小实蝇的前胸背板表皮增厚导致马拉硫磷穿透受阻,从而形成对马拉硫磷的穿透抗性。在此基础上,综合运用高通量转录组测序、生物信息学分析、生物素-链霉亲和素RNA Pull-down、双荧光素酶报告系统、荧光原位杂交、免疫组化、异源表达以及RNAi等技术和方法,系统揭示BdmiR-994调控表皮蛋白BdCPCFC介导桔小实蝇对马拉硫磷穿透抗性的分子机制。主要研究结果如下:1桔小实蝇对马拉硫磷穿透抗性的理化分析利用前胸背板点滴法在室内连续多代筛选获得桔小实蝇对马拉硫磷的抗性品系。经前胸背板点滴施药的生物测定表明,桔小实蝇马拉硫磷抗性和敏感品系LD50分别为3452.5、64.3 ng/fly,抗性倍数达53.6倍。与上述施药方式相比,桔小实蝇抗性与敏感品系经胸部注射马拉硫磷后LD50分别降至1344.1和44.1 ng/fly,表明前胸背板表皮在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性中发挥作用。使用高效液相色谱测定马拉硫磷的穿透率,结果显示在前胸背板点滴马拉硫磷处理后的1、3、6和9 h,其在抗性品系的穿透率分别为60.3%、70.7%、79.9%和84.6%,而在敏感品系则穿透率分别为83.1%、96.9%、98.0%和98.5%。可见马拉硫磷在抗性品系前胸背板处穿透受阻,且穿透率显著低于敏感品系。进一步使用透射电子显微镜观察桔小实蝇前胸背板的超微结构发现,抗性品系前胸背板的表皮厚度显著增加约4.5μm。因此,抗性品系表皮增厚导致马拉硫磷穿透路径增加引起穿透受阻,从而降低桔小实蝇对马拉硫磷的敏感性,最终产生对马拉硫磷的穿透抗性。2桔小实蝇与马拉硫磷抗性相关基因的挖掘基于构建的桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系高通量转录组文库,在抗性品系中共挖掘获得157个上调和266个下调表达基因。注释分析发现,抗性品系有18个表皮蛋白基因上调表达,分别属于CPR和CPCFC家族。采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）的验证显示,16个表皮蛋白基因在抗性品系中上调0.9至11.6倍,与转录组测序分析结果一致。进一步解析这些表皮蛋白在桔小实蝇成虫不同日龄的表达模式,结果显示Bd RR1-2、Bd RR1-32、Bd RR1-35和BdCPCFC在抗性品系多个日龄显著上调表达,表明其可能在抗性品系表皮结构改变中承担一定的功能。分析这些基因的组织表达模式发现,Bd RR1-2、Bd RR1-35和BdCPCFC分别在抗性品系前胸背板的表皮显著上调6.0、1.8和1.0倍,暗示这3个表皮蛋白基因在桔小实蝇抗性品系的前胸背板表皮的相关生理过程发挥作用。基于桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系的miRNA高通量转录组文库,鉴定获得75个已知miRNAs和372个novel miRNAs。其中,在抗性品系中下调的5个已知miRNAs中,4个TPM值均超过100。进一步分析其表达模式,BdmiR-994在抗性品系整虫及成虫前胸背板表皮分别显著下调80.0%和67.7%,暗示BdmiR-994可能通过靶向前胸背板表皮中的相关功能基因调控桔小实蝇对马拉硫磷的抗性。3桔小实蝇BdmiR-994对表皮蛋白基因BdCPCFC的靶向调控关系联合分析桔小实蝇过表达BdmiR-994（注射BdmiR-994 mimic）的转录组和桔小实蝇前胸背板表皮的转录组（包括抗性品系和敏感品系）,并结合4种miRNA靶基因预测软件的分析结果,最终获得4个候选靶基因。使用生物素-链霉亲和素RNA Pull-down分析发现,仅表皮蛋白基因BdCPCFC显著富集,说明桔小实蝇BdmiR-994与BdCPCFC能够直接作用。荧光原位杂交结果显示,BdmiR-994与BdCPCFC的荧光信号均在桔小实蝇前胸背板表皮富集,表明BdmiR-994和BdCPCFC在桔小实蝇体内同一位置表达。RT-q PCR与Western blot检测结果显示,注射BdmiR-994 mimic后,桔小实蝇BdmiR-994的表达量上调64.0倍,而BdCPCFC的表达量降低56.8%,同时虫体内的BdCPCFC蛋白也显著减少;注射BdmiR-994 inhibitor后,桔小实蝇BdmiR-994的表达量下调90.0%,而BdCPCFC的表达量上调1.1倍,同时虫体内的BdCPCFC蛋白也明显增多。进一步使用双荧光素酶报告系统的分析结果显示,BdmiR-994负向调控BdCPCFC的表达,BdmiR-994与BdCPCFC 3’端非编码区（UTR）的TCCTTA序列通过碱基互补配对结合。上述结果阐明了桔小实蝇BdmiR-994对BdCPCFC的靶向调控关系。4 BdmiR-994/BdCPCFC介导桔小实蝇马拉硫磷穿透抗性的分子机制基于BdmiR-994在桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系的表达模式,分别以BdmiR-994 mimic和inhibitor注射处理抗性和敏感品系试虫,利用透射电子显微镜观察其前胸背板表皮的厚度并进行马拉硫磷生物测定,分析BdmiR-994在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用。结果显示:注射BdmiR-994 mimic后,抗性品系桔小实蝇前胸背板表皮的厚度显著降低约3.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显著提升30.0%;注射BdmiR-994 inhibitor后,桔小实蝇敏感品系前胸背板表皮的厚度显著增加约1.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显著降低23.3%。上述结果表明BdmiR-994通过参与调控桔小实蝇前胸背板表皮的厚度影响其对马拉硫磷的敏感性,在桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性中发挥作用。克隆获得BdCPCFC开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸。生物信息学分析发现,BdCPCFC具有CPCFC家族特有的3个C-X（5）-C保守结构域。RT-q PCR分析发现,BdCPCFC在抗性品系中显著上调表达2.4倍。采用免疫组化、胶体金免疫定位和几丁质结合能力测定分析发现,表皮蛋白BdCPCFC位于桔小实蝇前胸背板表皮的几丁质片层中,且能有效结合几丁质树脂,表明BdCPCFC是桔小实蝇前胸背板表皮中的结构蛋白。注射ds BdCPCFC后,桔小实蝇BdCPCFC的表达量显著降低43.5%,蛋白含量明显减少,同时其前胸背板表皮的厚度显著降低约2.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显著提升30.0%。综上所述,桔小实蝇BdmiR-994通过靶向调控BdCPCFC的表达影响前胸背板表皮增厚,最终导致马拉硫磷穿透路径增加,从而形成穿透抗性。本学位论文的研究结果不仅丰富了昆虫杀虫剂穿透抗性的研究体系,为新型杀虫剂的研发提供了研究思路,同时为桔小实蝇田间抗性防控策略的制定奠定了理论基础。