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新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是继SARS-CoV,MERS-CoV之后,β属冠状病毒造成的第三次严重的爆发流行,该病毒自2020年2月底以来迅速传播到200多个国家。2020年3月11日,世界卫生组织宣布由SARS-CoV-2感染所致2019年冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）已经迈入全球大流行阶段。同年12月,在英国和南非检测到了两株具有更高传染性的SARS-CoV-2突变株,即VOC 202012/01突变株和501Y.V2突变株。截至2021年3月10日,全球已报道超过1亿病例和260万人死亡,全球死亡比例为2.2%,且这些数字在大多数国家仍呈上升趋势。严峻的疫情形势对人类经济社会和生命安全提出挑战,我们对SARS-CoV-2的细胞内生命过程仍知之甚少,研究处于迫切需求,而基于此的抗SARS-CoV-2新靶点发现无疑会成为抗疫的一针强心剂。自噬是进化上保守的细胞过程,细胞内形成双层膜结构的自噬小体,选择性地包裹有缺陷或受损的细胞内物质,包括长寿命的蛋白质和有缺陷的细胞器,如线粒体等。晚期阶段,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,其内容物在自噬溶酶体内被酶解和清除。细胞自噬过程激活后,降解受损的细胞器并清除病原体,具有防御和宿主保护作用。然而一部分长期存在、获得适应性的病毒包括麻疹病毒、HIV-1、基孔肯雅病毒、疱疹B病毒、柯萨奇病毒和冠状病毒等,针对性地进化出了一系列应对策略,劫持自噬元件,促进自我复制和转录。迄今为止,SARS-CoV-2与宿主细胞自噬过程之间的相互作用关系尚未得到阐明,本研究探讨了宿主细胞的防御性自噬和SARS-CoV-2侵入过程中对自噬的干扰和利用,并期望能够借此发现有效的治疗靶点。1.SARS-CoV-2抑制宿主细胞防御性线粒体自噬研究自噬具有防御和清除病原的作用,选择性线粒体自噬是自噬的特殊类型,异常线粒体被自噬小体包裹,在自噬溶酶体内被降解,为细胞代谢和新的线粒体生成提供底物。目前尚未有实验研究阐明SARS-CoV-2的基因组亚细胞定位,本部分实验采用免疫电镜和免疫荧光共定位技术标记SARS-CoV-2复制过程中的重要中间产物ds RNA,提出了线粒体与SARS-CoV-2复制之间存在密切联系。通过Tom20基因敲降技术,我们发现了线粒体外膜蛋白Tom20可能在SARS-CoV-2的线粒体定位和线粒体内复制过程中扮演了重要的角色。基于病毒在线粒体内的活动对线粒体功能的影响,我们通过JC-1染色、TMRM染色和CM-H2DCFDA探针分别检测了线粒体的膜电位、膜通道孔通透性和活性氧释放变化,结果显示SARS-CoV-2感染造成了包括线粒体膜电位去极化、膜通道孔通透性改变和活性氧应激在内的线粒体损伤病变,而通过线粒体膜稳定剂Mdivi-1和Cyclosporin A治疗线粒体损伤,对病毒的复制具有抑制作用,提示线粒体的功能异常为SARS-CoV-2复制提供了有利的条件。线粒体损伤是激活细胞内线粒体自噬清除程序的前提,通过Western Blotting和免疫荧光技术检测了线粒体自噬的经典通路,结果发现Pink1-Parkin蛋白表达量增加,且在线粒体聚积,同时我们通过敲降Pink1蛋白表达,发现由Pink1所调控的P62蛋白线粒体聚集,提示SARS-CoV-2感染激活了Pink1-Parkin通路,招募P62蛋白线粒体聚集。P62蛋白聚集的线粒体即标记成为自噬底物,异常的线粒体和病毒基因组将被自噬小体包裹,在溶酶体内降解清除。病毒干扰了这一过程,通过Western Blotting和免疫荧光技术,我们发现损伤的线粒体并未因Pink1-Parkin通路激活而得到有效清除,线粒体未成为自噬小体和溶酶体的底物。于是我们进一步采用免疫共沉淀技术,探索病毒的干预机制,结果发现SARS-CoV-2感染抑制了P62和LC3的相互结合,从而阻碍自噬小体对P62标记的线粒体进行包裹,线粒体自噬停留在了早期阶段。本部分提出线粒体与SARS-CoV-2复制之间存在密切联系,病毒感染造成宿主细胞线粒体损伤,宿主细胞通过Pink1-Parkin通路诱导线粒体自噬过程抵抗病毒感染。病毒通过抑制P62和LC3的结合,阻碍线粒体自噬以对抗宿主细胞的防御机制。2.SARS-CoV-2劫持自噬通路研究β冠状病毒MHV的NSP6蛋白可以激活Atg5依赖性自噬。表达SARS-CoV和MERS-CoV的NSP3 PLpro蛋白激活了自噬小体的形成通路,抑制自噬小体与溶酶体的融合过程,导致自噬小体蓄积。相似的,MERS-CoV病毒感染抑制Vero B4细胞自噬溶酶体形成。目前,仍未有正式发表的文章报道SARS-CoV-2诱导的上述细胞自噬过程和通路变化。本部分采用Western Blotting、免疫组化和透射电镜技术在SARS-CoV-2感染的非人灵长类动物肺组织、Vero E6细胞和Huh-7细胞中确认了病毒诱导的自噬小体数量增加。通过m Cherry-EGFP-LC3标记、自噬小体和溶酶体共标记、以及自噬底物的清除效率检测,确认了SARS-CoV-2诱导的自噬小体数量增加来源于（1）自噬小体生物合成增加,（2）自噬小体-溶酶体融合受阻,即自噬小体清除障碍。最后,本部分在Vero E6细胞上对介导自噬小体形成的级联通路进行了Western Blotting检测,结果显示SARS-CoV-2通过抑制Akt-mTOR通路,激活VPS34复合物并促进Atg5-Atg12、Atg16蛋白表达增加,上述通路变化与自噬小体生成增加相符合。本部分阐明了SARS-CoV-2侵入细胞后胞内自噬过程的变化,表现为自噬小体-溶酶体融合过程受阻,伴Akt-mTOR通路和VPS34复合物介导的自噬小体形成增加,导致自噬小体蓄积。3.自噬小体诱导蛋白VPS34作为潜在抗SARS-CoV-2靶点研究调节自噬被认为有希望成为潜在抗SARS-CoV-2策略之一。目前,自噬通路上尚未有明确的药物靶点,药物设计无从入手。前一章节中我们观察到了SARS-CoV-2感染宿主细胞后诱导的一系列宿主细胞自噬过程的改变,为明确自噬变化对病毒本身的意义,本部分针对自噬小体的形成通路,通过药物干预或siRNA干扰或基因敲除手段调节自噬相关蛋白的活性,检测Vero E6细胞内SARS-CoV-2的复制水平,结果发现VPS34蛋白抑制剂SAR405和3-MA,以及VPS34复合物关键亚基之一Atg14敲降,对SARS-CoV-2复制具有显著抑制作用,而Atg5基因敲除对病毒复制无明显影响。综上,我们筛选出候选的抗病毒靶点VPS34蛋白,并评价了VPS34抑制剂的体内抗SARS-CoV-2作用。在人血管紧张素转化酶II（Human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2）转基因小鼠模型上的结果表明,VPS34活性抑制剂3-MA显著抑制了SARS-CoV-2在hACE2转基因小鼠肺组织中的复制,并改善了肺炎损伤。相对的,mTOR抑制剂Rapamycin则加重了SARS-CoV-2感染。最后,我们进一步在人肺组织上评价了3-MA的抗病毒有效性,研究中首次报道了人肺移植小鼠可以作为SARS-CoV-2的感染模型,评价结果显示VPS34活性抑制剂3-MA显著抑制了SARS-CoV-2在人肺组织中的N基因和E基因拷贝,减少了可感染病毒颗粒数,且对SARS-CoV-2相关肺炎病变具有治疗作用。本部分提出抑制自噬诱导蛋白VPS34活性具有抗SARS-CoV-2作用,为药物设计提供了一条可行思路。4.自噬小体-溶酶体融合抑制剂体内外抗SARS-CoV-2作用评价自噬小体-溶酶体融合抑制剂抑制了自噬进程的终末阶段,前面章节中我们发现,SARS-CoV-2作用类似自噬溶酶体抑制剂。典型的自噬小体-溶酶体融合抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）在COVID-19流行早期就被用作治疗性药物之一,其机制可能为过度的自噬小体蓄积导致受感染细胞死亡,终止病毒的复制周期。目前,鲜少有研究报道除CQ外其他自噬小体-溶酶体融合抑制剂的抗SARS-CoV-2作用。本部分内容首先在细胞水平上评价了自噬小体-溶酶体融合抑制剂CQ、Bafilomycin A1和NH4CL的体外抗SARS-CoV-2作用,结果显示CQ、Bafilomycin A1和NH4CL抑制了SARS-CoV-2在Vero E6、Huh-7、293T-hACE2细胞中的复制。CQ和Bafilomycin A1提高了SARS-CoV-2感染后Vero E6细胞的存活率。体内实验结果表明,CQ和Bafilomycin A1抑制了SARS-CoV-2在hACE2转基因小鼠肺组织中的复制,改善了肺炎损伤。本部分内容提出了除CQ外,自噬小体-溶酶体融合抑制剂Bafilomycin A1作为潜在抗SARS-CoV-2候选药物的可行性。