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第一部分帕金森病(PD)患者以及各种PD动物模型中血清外泌体特点分析目的:比较PD患者与对照组人群血清来源外泌体含量差异及内含物差别,并比较PD动物模型外周血外泌体基本特点差异。方法:选取患病年限>5年的原发性PD患者及年龄、性别匹配的对照组患者,留取外周血10ml,分别利用试剂盒提取法和超高速离心法提取PD病人及对照组的血清外泌体,电镜下比较提取物形状;Western blotting验证外泌体特异性标志物CD63、TSG101表达,纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight)比较两组之间外泌体直径及浓度差别。动物模型中,将野生型雄性C57/B6J小鼠,囊泡单胺转运体2(VMAT2)敲低C57/B6J小鼠随机分为鱼藤酮干预组(鱼藤酮30mg/kg,间断性给予灌胃2月)与未处理组;并同时向C57小鼠腹腔注射MPTP(25mg/kg,每周2次,持续5周)致PD慢性模型。向正常SD雄性大鼠大脑立体定向6-OHDA造成偏侧损毁模型。Nanosight对各组PD模型动物血液中的外泌体进行定性和定量分析。结果:(1)采用超高速离心法及试剂盒提取法提取外泌体,获得电镜下呈杯口状或球形物质;试剂盒提取法所获提取物表达含量更高;Western blotting证实提取物中含有外泌体特异性标志物如CD63、TSG101等分子;Nanosight测量结果示提取物直径大小主要在30-120nm之间,并利用Nanosight比较各组所得提取物浓度,结果示PD患者相对于对照组人群外泌体含量增加;鱼藤酮干预后小鼠外周血外泌体含量增加,且在PD易患小鼠(VMAT2 50%敲低小鼠)经鱼藤酮干预后更加明显;MPTP干预小鼠较对照组小鼠外周血外泌体含量轻度增加;6-OHDA立体定向SD大鼠外周血外泌体含量较对照组明显增加。PD病人及对照、以及各组PD模型动物血清外泌体经Nanosight测量粒子最大量直径无明显差异。结论与对照组相比,部分PD动物模型中外周血清外泌体含量增加,且PD患者外周血外泌体含量增加。外泌体含量的差异有望成为反映疾病进程及疾病诊断的标记物。第二部分PD患者来源外泌体的致病性研究(细胞模型)目的:观察PD患者来源的血清外泌体对细胞模型的致病作用。方法:抽取PD病人外周血,利用PCR法排除SNCA基因突变患者。选取原发性PD患者(PD患病年限>5年)和对照组人群各10余例,Western blotting比较两组人群血清外泌体成分中α-突触核蛋白(α-syn)表达差异。并将PD患者和对照组人群的血清外泌体以及阳性对照鱼藤酮加入SH-SY5Y细胞中,CCK-8测定细胞活力,Westem blotting比较经不同处理后细胞表达α-syn差异,免疫荧光(IF)验证经不同处理后细胞病理性α-syn的沉积情况。结果:PD患者与对照组人群血清来源的外泌体均含有α-syn,而αα-syn寡聚体的含量在PD组明显增多,两组人群外泌体均无α-syn单体存在。Western blotting示PD患者外泌体可引起SH-SY5Y细胞中的α-syn表达增多,IF示PD病人来源的外泌体可引起细胞中的α-syn发生聚集。结论:PD患者血清来源的外泌体较对照组人群含有更多的α-syn寡聚体,并可以引起接受细胞发生寡聚化改变,最终导致α-syn聚集体形成。第三部分PD患者来源外泌体的致病性研究(全身注射动物模型)目的:观察尾静脉注射PD患者和对照组人群外泌体对不同遗传背景小鼠的影响。方法:小动物活体成像(IVIS)验证外泌体血脑屏障通透性,将两组血清外泌体经尾静脉注射入正常balb/c小鼠及B细胞、T细胞免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠体内3月,记录干预前及药物干预后小鼠体重变化情况。通过Western blotting和免疫组化或者免疫荧光观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)、α-syn、p-syn(ser129)、泛素、P62表达变化,HE染色观察中脑黑质区域路易小体形成。爬杆实验、转棒实验等观察小鼠行为学变化。结果:IVIS示外泌体可通过血脑屏障。给予PD外泌体干预后,小鼠体重相比对照组,出现轻度下降,Western blotting、免疫组化及免疫荧光等结果示野生型balb/c及NOD/SCID小鼠中脑黑质均出现TH表达降低,α-syn、p-syn(ser129)表达升高,HE染色示中脑黑质神经元出现胞体变形,细胞核深染等情况。爬杆实验、转棒实验等行为学提示小鼠出现轻度运动迟缓。结论:尾静脉注射PD外泌体,能够诱发正常balb/c和免疫缺陷NOD/SCID小鼠出现PD病理性和行为学改变。第四部分PD患者来源外泌体的致病性研究(立体定向注射动物模型)目的:观察纹状体立体定向注射PD患者外泌体后对小鼠PD发病过程的影响。方法:将正常balb/c小鼠颅内置管,间断性经纹状体立体定向分别注射PD患者外泌体2月,Western blotting、免疫组化或者免疫荧光观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)、α-syn、p-syn(ser129)、泛素、P62、IL-1β、IBA-1等表达变化,HE染色观察中脑黑质区域路易小体形成。高效液相色谱分析(HPLC)观察纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物变化。爬杆实验、转棒实验等观察小鼠行为学变化。阿朴吗啡皮下注射观察有无诱导出旋转行为。结果:Western blotting、免疫组化,及免疫荧光等结果示立体定向注射PD外泌体2月后出现TH表达降低,α-syn、p-syn(ser129)表达升高,并且泛素、P62、IL-1β、IBA-1表达均增高;HE染色示中脑黑质神经元出现胞体变形,细胞核深染等情况,且较尾静脉注射组变化更明显。HPLC进一步证实PD外泌体注射后可引起DA及其代谢产物表达下降。转棒实验结果示小鼠出现运动平衡障碍,爬杆实验则无明显改变,而皮下注射阿朴吗啡可诱导出偏侧旋转行为。结论:立定定向注射PD来源的血清外泌体能够直接引起黑质纹状体系统发生变性,导致小鼠模型PD病理学和行为学上的改变。