论文部分内容阅读
动物宰杀放血后,骨骼肌细胞在缺乏营养基质以及氧气供应下,钙离子浓度迅速升高,ATP类能量物质迅速降解,pH值在宰后一段时间内也显著下降。随着成熟时间的延长,这些细胞内环境的变化,细胞肯定会启动某种死亡程序,但究竟是哪一种程序,该程序对宰后牛肉肌细胞亚细胞功能结构,以及宏观品质有怎样重要的影响,目前还是未知数。至于细胞死亡发生在宰后的哪一个阶段,对应的有哪些生化反应,也不清楚。弄清这些问题,有利于我们对宰后肌肉转化成肉的过程中肉品品质变化机制的进一步理解。本文对三种不同部位牛肉的宰后细胞内环境变化,成熟过程中肌细胞的死亡方式进行了研究,对宰后不同阶段的细胞凋亡进行了定量,探索了凋亡酶caspase-3的活化及活化途径,并对caspases及细胞凋亡与牛肉嫩度变化之间的联系进行了探讨。1.牛肉bcl-2家族蛋白表达及宰后能量水平变化牛肉腰小肌(PM)、背最长肌(LM)和半腱肌(STN)的肌纤维类型构成存在显著差异,其中有氧代谢型纤维的比例腰小肌>背最长肌>半腱肌(p<0.05)。我们通过western blotting检测出35kDa的内参GAPDH蛋白,25kDa的bcl-2蛋白,22kDa的bax蛋白和23kDa bad蛋白。统计分析显示,STN肌肉中bax和bcl-2蛋白的表达显著低于PM肌肉(p<0.05)；而STN肌肉中bad蛋白的表达显著高于LM肌肉,LM肌肉的bad蛋白表达又要显著高于PM肌肉(p<0.05)。在宰后30min到3h和宰后8h到14hPM肌肉和LM肌肉的ATP含量显著下降(p<0.0001),STN肌肉的ATP含量在宰后30min到5h和宰后8h到14h显著下降(p<0.0001)。三种肌肉的pH值宰后迅速下降,ATP在宰后第14h显著降低,且能量代谢在18h内完成。pH值的迅速下降将会形成一个对caspases活化和凋亡发生有利的细胞内环境,而ATP宰后14h的分解则会抑制caspases的活化。2.牛肉肌细胞形态变化以及细胞凋亡率的研究随着贮藏时间的延长,牛肉肌细胞线粒体开始肿胀,部分脊突被清除呈空泡状,最后皱缩；细胞核染色质开始浓缩及边缘化,小的核颗粒被包裹成细胞凋亡的典型特质的类凋亡小体,最后呈现出继发性坏死的高电子密度的核染色质。TUNEL定量分析表明从第2天开始背最长肌(p<0.05)中的阳性细胞核呈显著的线性增多,半腱肌中的凋亡阳性细胞核在宰后第4天和第7天显著增多(p<0.05)。这三种肌肉中细胞核的凋亡数量在宰后第7天(p<0.05)有着显著差异,腰小肌的凋亡细胞核数量最多,其次是半腱肌,最后是背最长肌。HE、ACP和苔盼蓝阳性染色显示,细胞坏死也发生在宰后的牛肉中,这显示作为一个组织整体的骨骼肌,内部的细胞骨架蛋白的水解机制以及其他生化变化机制,并不是单一的、一种模式的。3.宰后牛肉肌细胞caspase-3的活化及途径通过Wetern blotting检测到细胞色素c的14kDa的蛋白条带,20和18kDa的caspase-3,23kDa的caspase-9,22kDa的caspase-8活化片断,PARP被劈开产生了36和24kDa两个小片段。牛肉背最长肌,半腱肌和腰小肌的胞浆细胞色素c含量在宰后第1天分别升高了4.5(p<0.0001),7.9(p<0.0001)和7.9倍(p<0.0001),caspase-3(背最长肌,p<0.001,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001),caspase-8(背最长肌,p<0.01,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001)和caspase-9的活力(背最长肌,p<0.001,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001)在第4h显著升高。宰后三种牛肉的caspase-3活力与caspase-8和caspase-9活力之间呈一定的相关性。caspase-3的激活是通过两种途径共同参与的,一种是caspase-8介导的受体途径,一种是细胞色素c和caspase-9介导的线粒体途径；肌肉之间第1天胞浆细胞色素c含量差异与促凋亡蛋白bax表达水平有关；宰后caspase-3,-8和-9活力达到顶点,随后的显著降低是由于ATP的消耗引起的。此外,PARP在宰后产生了一个36kDa的降解片断,这表明calpain介导的细胞坏死也发生在宰后牛骨骼肌的成熟过程中。4.宰后牛肉肌纤维收缩及品质变化研究成熟过程中肌肉的剪切力值在第4天显著下降(腰小肌,p<0.01；背最长肌,p<0.01；半腱肌,p<0.05),肌原纤维小片化指数第4天和第7天显著升高(腰小肌,p<0.01；背最长肌,p<0.05；半腱肌,p<0.01)。背最长肌和腰小肌的细胞间隙面积宰后第1天和第2天一直增加。宰后三种肌肉的肌节长度在第2天显著缩短,肌纤维超微结构在宰后贮藏过程中分别受到了不同程度的破坏。宰后三种肌肉的亮度值(L*)、红度值(a*)和黄度值(b*)在早期显著升高,红度值(a*)和黄度值(b*)随后显著下降。牛肉的剪切力值与caspase-3,-8和-9活力存在一定的正相关关系；腰小肌和背最长肌的细胞凋亡量与肌原纤维指数MFI呈显著正相关关系。caspases酶系统对细胞骨架蛋白的降解,以及凋亡现象在成熟过程中的发生,与成熟过程中牛肉的嫩度变化有关。