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本文利用已有的微生物基因组全序列信息资源,采用比较基因组学和生物信息学相结合的方法,发掘到S. aureus的新特异性检测标记,在此基础上建立了S.aureus PcR检测技术。其主要内容如下:
利用微生物基因组资源和比较基因组学的研究方法,采用perl编程语言编写了序列格式转化软件、基因组序列分割软件以及自动调用序列比对BLASTN的软件。通过S.aureus种内序列的比对分析,总共获得S. aureus种内保守的序列片段4009个,再将这些种内保守片段与其他微生物基因组序列进行比对分析,剔除其中相同的序列片段,保留下来1371个种间特异性片段,即为S. aureus分子检测标记。
对S.aureus检测标记序列进行基因注释和生物学原理的分析,筛选获得了3个S. aureus分子检测标记,sarA、permease和vicK三个基因序列。通过引物设计和PCR扩增,20株细菌验证表明:sarA、permease不具有金黄色葡萄球菌种的特异性;119株细菌验证表明:vick基因扩增得到预期的289bp特异性片段,显示vicK具有良好的种特异性,是S.aureus分子检测标记。
以vicK基因序列为S.aureus特异性检测标记,经过优化PCR反应体系的众多参数,建立了S.aureus PCR检测方法。该反应体系为:1μl Taq DNAPolymerase(2.5U/μl),5μl10×PCR Buffer,3μl MgCl<,2>(25 mmol/L),4μl dNTPMixture(各2.5 mmol/L),1μl vicKl,1μl vicK2,1μl模板DNA,34μlddH<,2>O;PCR反应参数为:95℃预变性5 min;94℃40s,52℃40 s,72℃1min,共35次循环;最后1次循环后72℃再延伸10min;检测灵敏度为5.5×10<3>拷贝/μl,具有良好的稳定性。