论文部分内容阅读
目的：评价磷霉素和多黏菌素E对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(Carbapenem-resistant Pseudomas aeruginosa, CRPA)体内、体外联合抗菌效应及探讨磷霉素对多黏菌素E肾毒性的保护作用,并初步分析85株临床分离CRPA的耐药机制。方法：(1)通过琼脂平板稀释法测定11种抗菌药物对85株CRPA的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC),采用微量肉汤稀释法,棋盘法设计测定磷霉素与多黏菌素E不同药物浓度组合对85株CRPA的MIC,计算联合抑菌指数(Fraction Inhibitory Concentration Index, FICI),判定两者的联合效应;采用时间—杀菌曲线观察磷霉素与多黏菌素E单用或联用对5株CRPA的抗菌作用,进一步判定两者联合效应。(2)通过亚抑菌抗菌药物浓度肉汤传代法用美罗培南诱导发光菌株铜绿假单胞菌(Pseudomas aeruginosa, PA) Xen5对碳青霉烯类药物耐药;建立CRPA腹腔感染小鼠模型,评价磷霉素和高、低剂量多黏菌素E单用及联用的治疗效果。(3)建立多黏菌素E大鼠肾毒性模型,评价磷霉素对多黏菌素E肾毒性的保护作用。(4)采用聚合酶链反应(PCR)检测85株CRPA是否存在VIM、IMP、 SPM、NDM-1和GIM五种基因型金属β内酰胺酶(Metal-beta-lactamase, MB L);利用琼脂平板稀释法分别测定美罗培南(Meropenem, MEP)、亚胺培南(Imipenem,IMP)有或没有外排泵抑制剂碳酰氰间氯苯腙(Carbonyl Cyanide m-Chlorophenyl hydrazone, CCCP)时对85株CRPA的MIC值,当联合CCCP后MIC值较单用MIC降低4倍或以上被认为该菌株为外排泵阳性,并利用实时荧光定量PCR方法检测4种外排泵基因MexAB-OprM, MexCD-OprJ, mexEF-OprN, mexXY-OprM中的MexB, MexD, MexF和MexY的表达情况;利用PCR扩增oprD2编码基因序列,观察oprD2基因变异情况,初步探讨85株CRPA耐药机制的分布情况,并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)的方法分析85株CRPA菌株的同源性。结果：(1)磷霉素与多黏菌素E联合应用时,91.76%(78/85)菌株多黏菌素E的MIC<0.5mg/L,明显高于其单用MIC<0.5mg/L菌株所占比率(25.88%)；85株CRPA的FICI分布为：FICI≤0.5占21.18%,0.5<FICI<1占27.06%,FICI=1占5.88%,1<FICI<2占45.88%,未发现FICI>2;时间—杀菌曲线：磷霉素和多黏菌素E在1/2MIC和MIC联合时对PA1、PA2、PA3、PA4有协同杀菌作用,对PA5,仅在MIC联合时有协同杀菌作用,且在联用磷霉素后,多黏菌素E单用时的细菌再生长被抑制。(2)CRPA腹腔感染小鼠,在药物治疗5h内,磷霉素,低剂量多黏菌素E单用比两者联合效果差,且低剂量多黏菌素E感染有所加重;多黏菌素E高剂量的抗菌作用优于其低剂量,提示多黏菌素E抗菌作用具有浓度依赖性；高剂量多黏菌素E组、磷霉素和高剂量多黏菌素E联合组小鼠生物发光强度(CPS)差异无统计学意义(P>0.05),但根据脏器实际载菌量比较,后者(联合组)肝脏、肾脏、肺脏以及血液系统实际载菌量少于前者(多黏菌素高剂量单用)(P<0.05);各脏器组织病变主要在肝脏、肺脏、肾脏,对照组病变较重,高剂量多黏菌素E组,磷霉素分别与高、低剂量多黏菌素E联合组病变程度有所减轻。(3)成功建立多黏菌素E大鼠肾损害模型,多黏菌素E组大鼠血肌酐和尿NAG酶水平增高,和对照组、联合用药组(磷霉素和多黏菌素联合)比较差异均有统计学意义(P<0.05);磷霉素和多黏菌素E联合组与对照组比较血肌酐和尿NAG酶水平差异无统计学意义(P>0.05)；肾脏病理切片半定量评分比较结果显示多黏菌素E组肾脏损害明显,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05),而磷霉素和多黏菌素E联合组基本正常。(4)85株CRPA耐药机制的研究显示：85株CRPA不产VIM、IMP、SPM、NDM-1和GIM五种基因型MBLs;外排泵抑制剂CCCP可以使9株CRPA亚胺培南或美罗培南MIC值降低4倍或以上,占10.59%,其中MexAB高表达有5株,MexCD高表达有5株,MexEF高表达有1株,MexXY高表达有7株：69株(69/85,81.18%)CRPA出现oprD2基因小片段或大片段缺失等变异;经PFGE分析发现,85株CRPA被分为32个PFGE指纹型,在三家医院间PFGE指纹型中菌株相似≥90%以上所占比率较少,说明流行趋势以散发为主,未有爆发流行。结论：(1)磷霉素与多黏菌素E联用对CRPA以协同和部分协同作用为主,未发现拮抗作用；两者联用后可以明显降低CRPA多黏菌素E的MIC值。(2)磷霉素和多黏菌素E高、低两个剂量联用对小鼠腹腔CRPA感染有很好的协同抗菌作用,为临床应用提供实验基础。(3)磷霉素可减轻多黏菌素E所致的肾损害作用。(4)85株CRPA的耐药机制,以oprD2基因缺失和突变为主要机制,其次外排泵机制,未发现产VIM、IMP、SPM、NDM-1和GIM型MBLs的菌株,CRPA可能还存在其他耐药机制,有待进一步研究。