富氢水通过LAMP2调节自噬减弱内毒素诱导的脓毒症胰腺损伤

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目的:胰腺损伤的发生是脓毒症的重要病理改变,其严重程度可能是判断脓毒症预后的指标。在LPS诱导的脓毒症模型中,胰腺损伤已被证实。自噬是一种将受损的细胞器和功能失调的蛋白质聚集物降解,从而完成细胞内物质和能量代谢循环的保守过程。LPS可以诱导脓毒症中的自噬,但通常伴随自噬受损,导致自噬体的积累造成胰腺损伤,且与胰腺炎类似。溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)是完成自噬过程的关键分子。研究发现在酒精性和非酒精性等各型胰腺炎模型和人胰腺炎中都存在LAMP2降低。氢分子具有抗炎、抗凋亡、抗休克和调节自噬等作用,常用于治疗脓毒症器官损伤等多种疾病。然而,氢分子在LPS诱导的脓毒性胰腺损伤中的作用尚未被研究。本研究将探究富氢水(HRS)对LPS诱导的胰腺损伤的作用,及其作用机制与自噬之间的关系。研究方法:将C57BL/6J小鼠分为3组:(1)对照组(Control组);(2)LPS诱导的脓毒症胰腺损伤模型组(LPS组);(3)脓毒症胰腺损伤富氢水治疗组(LPS+HRS组)。a.观察小鼠的行为学表现;b.胰腺组织苏木素伊红(hematoxylin eosin,HE)染色和改良Schmidt组织病理学评分,观察和评价胰腺组织的病理变化;c.酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清淀粉酶和胰腺组织中白介素(IL)-6与肿瘤坏死因子(TNF)-α、和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)以及脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA);d.原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测胰腺组织中的细胞凋亡;e.免疫印记(Western Blot,WB)试验检测胰腺组织中的Caspase-3蛋白、LC3和p62,以及LAMP2蛋白的表达变化;f.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术检测胰腺组织中的Caspase-3m RNA、LC3和p62,以及LAMP2 m RNA的表达;g.免疫荧光标记LC3蛋白和LAMP2蛋白评价胰腺组织自噬流,即自噬体和自噬溶酶体变化。结果:a.与Control组相比,LPS组动物表现为嗜睡、发冷、行动迟缓,梳毛活动减少,并出现严重腹泻;LPS+HRS组小鼠嗜睡和寒战程度减轻、梳毛活动增加、腹泻减轻、排泄物减少。b.HE染色结果示,与Control组相比,LPS组的胰腺组织出现了水肿、炎细胞浸润、出血及坏死的情况,各项及总改良Schmidt组织病理学评分均升高(P均<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组水肿、炎症细胞浸润、出血及坏死程度减轻,各项及总改良Schmidt组织病理学评分降低(仅总改良Schmidt组织病理学评分P<0.05);c.ELISA结果示,与Control组相比,LPS组小鼠血清淀粉酶含量升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组血清淀粉酶含量降低(P<0.05);与Control组相比,LPS组小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α含量、以及MPO和MDA活性升高(P均<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α含量、以及MPO和MDA活性降低(P均<0.05);d.TUNEL结果示,与Control组相比,LPS组小鼠胰腺组织细胞凋亡增多,凋亡率升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组凋亡减少,凋亡率下降(P<0.05);WB和q RT-PCR结果示,与Control组相比,LPS组小鼠胰腺组织中Caspase-3蛋白及m RNA表达升高(P均<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组Caspase-3蛋白及m RNA表达降低(P均<0.05)。e.WB和q RT-PCR结果示,与Control组相比,LPS组小鼠胰腺组织中LC3II/I和p62蛋白表达升高,LC3 m RNA和p62 m RNA表达升高,LAMP2蛋白和m RNA表达降低(P均<0.05);与LPS组相比,LPS+HRS组LC3II/I和LC3 m RNA表达进一步升高,p62蛋白和m RNA表达降低,LAMP2蛋白和m RNA表达升高(P均<0.05);免疫荧光标记LC3和LAMP2蛋白结果示,与Control组相比,LPS组LC3阳性细胞增多,LAMP2阳性细胞减少,即自噬体形成增多,自噬溶酶体形成减少;与LPS组相比,加入HRS后LC3阳性细胞进一步增多,LAMP2阳性细胞增多,即自噬体形成进一步增多,自噬溶酶体形成减少有所改善。结论:富氢水可通过调节LAMP2表达促进自噬完成,从而抑制炎症、氧化应激和凋亡参与脓毒症胰腺损伤的保护作用。
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