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双苯氟嗪（dipfluzine，Dip）是我校药学院首创设计合成的一个新型的桂利嗪类衍生物，已采用生理、生化及形态学多项技术，在大鼠全脑缺血模型从不同角度证明Dip对缺血性脑损伤有明显的保护作用，且此种保护作用与其选择性扩张血管、增加脑血流、改善脑缺血能量代谢、降低缺血脑兴奋性氨基酸浓度及阻滞钙通道有关。鉴于溶栓疗法目前已被临床首选治疗脑梗塞病人，细胞凋亡已被认作缺血再灌注脑损伤，特别是迟发性神经元死亡的主要形式，本研究拟在大鼠中动脉缺血再灌注模型，以细胞凋亡和自由基产生作为主要评价指标，进一步观察双苯氟嗪对脑缺血再灌注所致脑损伤有无保护作用，并从双苯氟嗪对Caspase-3、细胞色素c （Cytochrome c，Cyt c）、Bcl-2及线粒体通透性转变（Mitochondrial permeability transition,MPT）等细胞凋亡相关因素的影响，进一步阐明其保护缺血再灌注脑损伤的分子机制。实验内容和结果如下：1 不同脑缺血再灌注时间所致脑损伤模型比较目的：研究脑缺血再灌注后不同时相细胞损伤的变化，以确定评价抗缺血药物的最佳模型。方法：选择54只，随机分为9组， 假手术组，缺血1h再灌注0.5h组,缺血1h再灌注2h组， 缺血2h再灌注0.5h组,缺血2h再灌注2h组, 缺血3h再灌注0.5h组, 缺血3h再灌注2h组, 缺血6h再灌注0.5组, 缺血6h再灌注2h组,每组6只动物。采用Zea-Longa等线栓法，建立大脑中动脉栓塞（MCAO）动物模型。于实验结束后，采取所需标本。采用HE和甲苯安蓝染色于光镜下观察组织凋亡的变化。采用免疫组织学方法检测caspase-3蛋白的改变。采用酶标仪测定MDA的含量变化。以评价各项指标反映缺血再灌注脑损伤的灵敏程度，比较不同缺血时间与再灌注时间多脑损伤程度的影响。结果：HE染色组织学观察 假手术组无明显异常变化，缺血1h<WP=5>再灌注0.5h组未见明显的神经细胞坏死，缺血1h再灌注2h组有散在坏死细胞，而缺血2h以上组不管再灌注时间长短,其皮质和纹状体出现细胞肿账，胞核碎裂、溶解、固缩，及染色质浓缩、空泡化等病理改变。甲苯安蓝染色: 缺血1h 再灌注0.5h可见散在的甲苯安蓝染色阳性细胞, 缺血1h 再灌注2h 和缺血2h 再灌注0.5h阳性细胞表达增多, 至缺血2h 再灌注2 h时与缺血3h、6h组相似均出现大量甲苯安蓝染色阳性细胞。假手术组仅有少量阳性细胞表达。各组Caspase-3蛋白表达结果与甲苯安蓝染色结果相似，缺血1h 再灌注0.5h可见散在的Caspase-3蛋白的表达阳性细胞, 缺血1h 再灌注2h 和缺血2h 再灌注0.5h阳性细胞表达增多, 至缺血2h 再灌注2h时阳性细胞已表达成群,同缺血3h再灌注和缺血6h再灌注组相似，假手术组有少量阳性细胞表达。 MDA含量，缺血1h 再灌注0.5h组MDA的含量较低，随缺血再灌注时间的延长MDA的含量呈递增趋势。结论：本实验用的HE染色、甲苯安蓝染色、caspase-3蛋白及MDA指标均随脑缺血再灌注时间的延长而明显改变，提示可作为从不同角度反映脑缺血再灌注损伤的灵敏指标，而这些指标均在缺血2h再灌注2h时达到显著改变，可用作评价抗脑缺血药物的动物模型。2 双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响目的：研究双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响。方法：取大鼠30只，随机分为5组，假手术组，溶剂对照组及双苯氟嗪小、中、大三个剂量组，每组6只。采用Zea-Longa等线栓法建立MCAO动物模型，于再灌注前40min分别给各组动物腹腔注射生理盐水、溶剂或双苯氟嗪20mg、40mg和80mg.kg-1，再灌注2h后处死动物，取标本用于各项指标检测，其中采用HE观察脑组织损伤变化，采用FCM观察组织凋亡百分率变化，采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术检测脑组织神经细胞的凋亡。采用酶标仪检测SOD活性及MDA、的含量。结果：HE染色 溶剂对照组，皮质和纹状体出现细胞肿账，胞核碎裂、溶解、固缩，染色质浓缩及空泡化等改变。给予双苯氟嗪治疗后可减轻上述各种损伤，假手术组未见上述变化。<WP=6>原位凋亡检测（细胞个数/高倍视野），假手术组可见少数凋亡细胞（21(6 ）， 溶剂对照组细胞凋亡发生率明显增加（86(4），给予双苯氟嗪后凋亡细胞显著减少，其中双苯氟嗪20 mg.kg-1组为62(8 （P(0.01），40 mg.kg-1为51(6 （P(0.01）, 双苯氟嗪80 mg.kg-1组为30(7, （P(0.01）可显著抑制神经细胞的凋亡。 用FCM检测细胞凋亡百分率，假手术组DNA为5.9(0.9，溶剂对照组明显增加为17.6(1.9，给予双苯氟嗪80 mg.kg-1组凋亡率下降为9.1 (1.0，双苯氟嗪40 mg.kg-1组为12.5(2.2，双苯氟嗪20 mg.kg-1组为14.0(1.7。MDA (nM.ml-1)含量：假手术组为6.1(1.1，溶剂对照组增加为13.5(1.5，给予双苯氟嗪后MDA含量显著下降。SOD (NU.mg prot-1)活性： 溶剂组（108(14）显著降低于假手术组（139(9，P(0.05），给双苯氟嗪后SOD活性增加(136(11, Dip80, P(0.01)。O2 (NU.ml-1)的含量：溶剂组（580(54）显著降高于假手术组（421(62，P(0.05），给双苯氟嗪后降低（（Dip80、440(45、 P(0.01，Dip40、470(43，P(0.05，Dip20、475(52、P(0.05）。结论： 缺血再灌注时，脑组织有明显的损伤，表现为大量的凋亡细胞和坏死细胞，缺血