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目的:人高致病性禽流行性感冒,简称人禽流感(human-avian influenza )是由禽甲型流感病毒中某些亚型毒株突破种属感染人而引起人类的一种急性呼吸道传染病。禽流感病毒H5N1除导致急性肺损伤外,还引起免疫系统损害。大量研究已经表明:病毒介导了宿主病理性免疫应答,引起急性免疫损伤是导致严重的急性呼吸综合症、呼吸衰竭以及免疫系统功能障碍的主要原因。研究还提示:抗病毒药联合免疫调节制剂可能是防治急性免疫损伤且有效抗病毒感染的新策略。我们实验室在SARS(Severe Acute Respiratory Syndromes)的发病机制的研究中发现,SARS-CoV(Severe Acute Respiratory Syndromes Coronavirus)表面的Spike蛋白可以激活JAK-STAT(Janus kinase -Signal Transducer and Activator of Transcription )信号通路,介导免疫损伤,JAK3(Janus kinase 3)是关键信号靶分子。选择性JAK3抑制剂能对抗SARS的免疫损伤作用,提高感染SARS小鼠的生存率,并对免疫细胞具有保护作用。基于SARS和人禽流感病毒感染介导的临床病理生理过程有诸多共同之处,我们推测:禽流感病毒通过其表面膜蛋白HA (hemagglutinin protein),可能激活了共同的信号分子靶标,引起急性免疫损伤。为了证实这一问题,本研究在前期工作的基础上,采纳JAK3基因敲除小鼠研究了抑制JAK3激酶的活化对H5N1病毒HA蛋白介导的免疫损伤的保护作用,旨在于寻找一种能够特异性靶向病毒介导的免疫损伤,并对免疫系统同时具有保护作用的小分子抗炎制剂,为人禽流感H5N1的免疫损伤治疗提供新的策略。研究内容和方法:一、气道内滴注H5N1病毒HA蛋白对JAK3基因敲除和对JAK3基因野生型对照小鼠外周免疫器官的影响。1.各16只6-8周雄性JAK3基因敲除小鼠B6129S4-JAK3tm1Lj(bJAK3-/-)和JAK3基因阳性对照鼠B6129SF2/J(JAK3+/+),各随机分为PBS空白对照组、HA蛋白组(90ug),经气管内滴注给予。2. 72小时后处死小鼠,分离肺和脾脏,并予以常规组织固定、包埋和切片,进行HE染色、免疫组化观察IP-10 (Interferon-gamma-inducible protein 10)的表达。二、气道内滴注H5N1病毒HA蛋白对脾细胞的免疫损伤在JAK3基因敲除和JAK3基因野生型对照小鼠的不同影响各16只6-8周雄性JAK3-/-小鼠和JAK3+/+小鼠,随机分为PBS空白对照组、HA蛋白组,经气管内滴注给予,72小时后处死小鼠,分离脾脏。1. JAK3-/-小鼠(PBS处理)、JAK3-/-小鼠(HA处理)、JAK3+/+小鼠(PBS处理)和JAK3+/+小鼠(HA处理)各组小鼠分别分离脾脏细胞,各又分为LPS(-)组、LPS刺激12H组、LPS刺激24小时组,每组不同处理因素各3复孔。CCK-8法检测脾细胞LPS刺激后的损伤指数。2.检测各组小鼠脾细胞LPS刺激24小时后分泌Eotaxin、IFN-γ,IL-2,IL-4,IL10,IL-13,IP-10,MIP-1a,MCP-1,Rantes等细胞因子和趋化因子的水平。结果:一、第一部分1. JAK3+/+小鼠气道内滴注HA后可见显著呼吸急促,活动明显减少,症状持续时间长。相比之下,JAK3-/-小鼠HA处理后上述临床症状较轻且消失早。2. HA处理的JAK3+/+小鼠肺与脾组织病理表现为局部性弥漫性肺泡损伤,单核细胞侵润,脾脏肿胀,毛细血管充血,生发中心局部结构破坏,有空泡样改变,淋巴细胞减少,见较多大单核吞噬细胞。HA处理的JAK3-/-小鼠肺及脾组织的损伤明显减轻。脾脏结构未见明显异常。3. HA处理的JAK3+/+小鼠较之JAK3-/-小鼠脾脏淋巴细胞呈现广泛IP-10阳染。二、第二部分1. JAK3+/+小鼠与JAK3-/-小鼠HA预处理后脾细胞对LPS刺激的损伤指数高于PBS组,JAK3-/- HA预处理组小鼠对LPS反应的损伤指数明显低于JAK3+/+HA组小鼠(P﹤0.05)。2. JAK3+/+HA预处理组小鼠脾淋巴细胞在无LPS刺激的基态下,IP-10,MCP-1a,Rantes的值明显高于JAK3+/+PBS对照组,(P﹤0.05);HA预处理组小鼠脾淋巴细胞LPS刺激24小时较PBS预处理LPS刺激组显著提高了IFN-γ,IP-10,MCP-1a,Rantes的释放水平(P﹤0.05)。3. JAK3-/-HA预处理小鼠脾细胞无LPS刺激基态下释放IP-10、MCP-1a、Rantes的水平明显低于JAK3+/+HA预处理组小鼠脾淋巴细胞基态的释放水平(P﹤0.05)。JAK3-/-HA预处理组LPS刺激24h后,IFN-γ,IP-10,MCP-1a,Rantes的分泌量亦显著低于JAK3+/+HA预处理组LPS刺激下的释放水平(P﹤0.05)。结论:1.气道给于H5N1 HA表面膜蛋白能够始动异常的免疫应答,引起急性肺损伤和外周淋巴器官与免疫细胞破坏。JAK3-/-小鼠能够耐受HA介导的免疫损伤,减小脾脏细胞重要的早期趋化因子IP-10的诱导。2. JAK3-/-小鼠对HA介导的免疫损伤效应具有保护作用;显著减轻了继而的LPS刺激导致的脾细胞损坏。JAK3-/-小鼠脾细胞对HA介导的免疫损伤呈现耐受,以及嗣后对LPS刺激的低反应性是其具有显著下调免疫炎症反应相关的趋化因子的生成释放的结果。3.抑制JAK3激酶的活化能显著减轻H5N1病毒HA蛋白的免疫损伤效应,提示选择性的靶向JAK3能够有效对抗病毒介导的免疫损伤,减小免疫系统的损伤反应