自发生物光子辐射(SPE)是自然界普遍存在的一种生物辐射现象,存在于各种动物、植物、藻类及微生物系统之中。作为生物系统的本质属性,SPE主要来源于生物体内新陈代谢过程中生物活性分子或基团(如1O2,1P*,3(R=O)*等)由高能态向低能态的跃迁过程中释放的能量。因此,研究者普遍认为SPE与机体内的代谢状态密切相关。机体内的每一个生物活性分子或基团在发生能量迁移时都会辐射特定波长的光子。当有机体受到外界或内部因素影响生理或病理状态出现异常时,其代谢状态必然发生改变,相关生物活性分子的种类和数量也会随之改变,从而导致有机体的SPE特性的改变。因此,SPE也许可以作为一种潜在的、无损的生物物理指标用于反映生物系统的代谢状态。众所周知,肿瘤细胞的代谢状态不同于正常细胞:正常细胞在氧气充足的条件下进行氧化磷酸化,在氧气缺乏时主要以无氧糖酵解为主,以减少对氧气的损耗;而肿瘤细胞即使是在氧气充足的条件下也会使用糖酵解作为其主要的能量来源。正是由于在代谢方面的不同,肿瘤细胞内的生物活性分子的种类和数量与正常细胞存在差异,由此可能导致来源于肿瘤细胞的SPE与正常细胞显著不同。因此,许多研究者将SPE作为一种新颖的生物物理指标用于肿瘤的研究中。但是,目前大部分研究主要集中在细胞或组织水平,而直接在动物水平上,通过探测有机体体表的SPE变化特性来进行肿瘤研究的报道非常稀少;对于肿瘤生长、转移过程中的有机体体表SPE动态变化的研究则未见报道。研究目的及意义1.通过与荷兰Meluna研究所合作,建立生物光子光谱和光强两套探测系统,并对其性能进行测试,实验条件进行优化,获得两套探测系统的最佳工作状态,为后续实验顺利进行做铺垫。2.通过对肿瘤发生、发展和转移过程中MDA-MB-231及MCF7两种不同类型荷瘤鼠体表不同部位的SPE光谱和光强信号进行探测,获得体表SPE光谱和光强信号在肿瘤不同生长状态下的动态变化特点,探讨体表SPE信号对体内肿瘤类型及不同生长状态的敏感性,希望一方面可以弥补SPE在肿瘤方面研究的不足,另一方面为SPE用于肿瘤的研究提供更多的数据支持,同时,为肿瘤的研究尤其是在早期阶段提供新视角。3.通过多个数理模型来对实验数据进行分析处理,寻找可表征SPE光谱和光强信号特性的特征参数,以期实现对体表SPE光谱和光强信号特性的定量化处理。4.通过对两种不同类型荷瘤鼠体表SPE光谱和光强信号特征参数与血清中代谢相关活性物质以及肿瘤组织中微血管密度的相关性进行分析,探讨荷瘤鼠体表的SPE光谱或光强信号的动态变化是否与其体内代谢状态改变相关联。研究方法1.对两台生物光子探测系统进行组装,并设计、制作各自样品台,以固定实验裸鼠的位置;对两台探测系统的背景噪声进行探测,观察两台探测系统性能的稳定性;通过探测光电倍增管(PMT)前快门处于打开和关闭两种状态下的噪声来确定暗室的密闭性;通过探测不同室温条件下,探测系统的背景噪声的变化来确定最佳的实验环境;通过对PMT制冷系统达到预设的制冷温度所需要的时间进行探测,以确定PMT制冷系统预制冷时间。2.以BALB/c雌性裸鼠为实验对象,建立MDA-MB-231及MCF7两种不同分子类型的乳腺癌荷瘤鼠模型。然后,用不同浓度的异戊巴比妥钠麻醉实验裸鼠,观察麻醉深度及麻醉时间,以确定所需麻醉剂的剂量。用两台探测系统对裸鼠受外界光源照射后的延迟发光的弛豫时间进行探测,以确定裸鼠实验前需要暗适应的时间,从而消除外界光源对本实验的影响。3.利用生物光子光谱探测系统,分别在乳腺癌的发生、发展和转移过程中的不同阶段,探测两种不同类型荷瘤鼠右侧病灶部位及左侧、腹部和背部三个正常部位体表的SPE光谱动态分布,同时对健康对照鼠的同样部位的SPE光谱进行探测。探测时间间隔为1 s,每只鼠、每个部位在每个滤波片下的探测时间为120 s,共使用6个不同波长的滤波片进行探测。对所得数据进行汇总、分析处理,计算每个波段处的光子强度及不同波段间的比率,寻找能表征光谱特性的参数。最后,利用主成分分析法(PCA)分析荷瘤鼠体表的SPE光谱特征参数对荷瘤鼠和健康对照鼠以及肿瘤处于不同生长阶段的荷瘤鼠之间的区分能力。4.利用生物光子光强探测系统,探测在乳腺癌发生、发展及转移过程中,两种不同类型荷瘤鼠右侧病灶部位及左侧、腹部和背部三个正常部位体表的SPE光强信号的动态变化特点。探测时间间隔为0.05 s,每只鼠、每个部位的探测时间为600 s,探测12,000个点。然后,对所得数据进行汇总,采用多个数理模型进行分析处理,寻找能表征SPE光强信号特性的特征参数。最后,利用PCA法分析荷瘤鼠体表的SPE光强信号特征参数对荷瘤鼠和健康对照鼠以及肿瘤处于不同生长阶段的荷瘤鼠之间的区分能力。5.肿瘤转移情况检测:在MDA-MB-231及MCF7荷瘤鼠SPE光谱或光强探测完毕后,将其处死,取其肝、脾、左右肺、左右肾及左右上肢腋下淋巴结用4%的多聚甲醛进行固定,通过HE染色法检测肿瘤细胞转移情况。6.提取两种不同类型荷瘤鼠在肿瘤不同生长阶段的血清及肿瘤组织,对血清中的一些活性代谢指标(包括过氧化氢、丙二醛、超氧化物歧化酶及总抗氧化能力)利用相应的试剂盒进行分析。同时,借助免疫组织化学的方法检测肿瘤组织中可反映血管生成状态的微血管密度标志物CD31的表达情况。采用Pearson相关分析法,对肿瘤生长过程中两种不同类型荷瘤鼠体表的SPE光谱及光强信号特征参数与血清中的活性代谢指标以及肿瘤组织中的微血管密度的相关性进行分析。研究结果第一部分生物光子探测系统的组装及性能稳定性研究1.生物光子光谱探测系统:与荷兰Meluna研究所共同完成了该探测系统的线路设计、零部件购买和组装;并自行设计了两个可上下调节高度并经过发黑处理的样品台,用以固定实验裸鼠的位置;对探测系统背景噪声连续30天的测试结果表明,该系统的背景噪声随时间的变化波动很小,稳定性非常好;PMT前快门打开后系统噪声较快门关闭后有所升高,但是差异不具有统计学意义,说明该系统的暗室的密闭性非常好;通过对不同室温条件下探测系统背景噪声探测,最终选择在25 ℃室温条件下进行实验。2.生物光子光强探测系统:对生物光子光强探测系统进行组装和调试,设计了一个可固定裸鼠的样品台;探测了 PMT制冷系统达到预设的制冷温度所需要的时间,结果表明,在实验开始前2小时打开PMT制冷系统可确保探测系统背景噪声的稳定性;对探测系统背景噪声连续40天的探测结果显示,探测系统的背景噪声随时间波动很小,系统性能良好。3.用不同浓度的异戊巴比妥钠麻醉实验裸鼠结果表明,70 mg/Kg为最佳麻醉剂量;将麻醉后的裸鼠暗适应时间定为20 min时可确保消除外界光源对裸鼠体表SPE的影响。第二部分乳腺癌发生、发展和转移过程中荷瘤鼠体表SPE光谱动态变化特性的研究1.MDA-MB-231荷瘤鼠病灶部位及三个正常部位体表的SPE光谱分布在乳腺癌发生、发展及转移过程中的动态变化特点分析:病灶部位体表的SPE光谱对于体内肿瘤变化状态的灵敏度显著高于三个正常部位,病灶部位光谱分布在乳腺癌处于潜伏期时已经发生改变,并且在肿瘤不同生长阶段表现出显著的差异,光谱峰发生红移,当肿瘤生长到一定阶段时,在610-630 nm波段出现第二个光谱峰;左侧和背部体表的SPE光谱分布在乳腺癌处于潜伏期时与健康对照鼠的差异不明显,但是随着肿瘤的发展,差异越来越明显,并显示出一定的规律性,尤其是在610-630 nm波段;而腹部体表的SPE光谱分布对于体内肿瘤的灵敏度虽弱于病灶部位,但在肿瘤处于潜伏期时,其对荷瘤鼠的区分准确率已达到75%,并且随着肿瘤的发展,区分准确率逐渐升高,变化较大的波段主要为495-550 nm、550-610 nm 以及 610-630 nm。2.MCF7荷瘤鼠病灶部位及三个正常部位体表的SPE光谱分布在乳腺癌发生、发展及转移过程中的动态变化特点分析:MCF7荷瘤鼠病灶部位体表的SPE光谱分布在肿瘤发展的整个过程中均与MDA-MB-231荷瘤鼠显示出较大的差异,其在乳腺癌处于潜伏期时与健康对照鼠相比差异不大,仅在610-630 nm波段光子信号强度显著高于健康对照鼠,此时对荷瘤鼠和健康对照鼠的区分准确率仅为65%,但是随着肿瘤的发展,病灶部位体表的SPE光谱分布逐渐区别于健康对照鼠,当肿瘤发展到一定阶段时,该部位体表的光谱峰由495-550 nm波段红移到550-610 nm波段;左侧、腹部和背部体表的SPE光谱分布在乳腺癌处于潜伏期时均与健康对照鼠的差异不明显,但是随着肿瘤的发展,这些部位体表的光谱变化与健康对照鼠差异加大,主要在495-550nm、550-610nm以及550-610nm波段,并且,腹部SPE光谱信号对肿瘤的灵敏度高于左侧和背部。3.通过对比发生肿瘤转移和未发生肿瘤转移的荷瘤鼠体表光谱动态分布和特征参数的变化特点,结果显示,当荷瘤鼠体内肿瘤发生转移时,其体表的SPE光谱特征也会发生显著性的改变,尤其是在病灶部位和腹部的395-455 nm,550-610 nm和610-630 nm波段,明显不同于未发生肿瘤转移的荷瘤鼠。但由于实验条件限制,我们不能明确荷瘤鼠在哪次探测时发生的肿瘤转移,这个结论还有待进一步验证。第三部分乳腺癌发生、发展和转移过程中荷瘤鼠体表SPE光强信号动态变化特性的研究1.对乳腺癌发生、发展及转移过程中,两种不同分子类型荷瘤鼠的病灶部位及三个正常部位体表的SPE光强信号的动态数据进行数理统计分析发现,荷瘤鼠体表4个不同探测部位的SPE光强信号强度K,右侧病灶部位、左侧及腹部3个探测部位的光强信号强度K与背部光强信号强度K的3个比率(Ratio1、Ratio2及Ratio3)以及Fano因子曲线的截距和斜率这6个参数均携带有与体内肿瘤生长相关的生物信息,并且,不同特征参数对不同类型肿瘤及不同探测部位的敏感度不同,可从不同的角度反映两种不同分子类型荷瘤鼠体内肿瘤的生长状态,具有互补性。因此,这6个参数可以作为特征参数来表征SPE光强信号的特性,其参数组合显著提高荷瘤鼠体表SPE信号对体内肿瘤的灵敏度。2.SPE光强信号的参数组合在不同类型的荷瘤鼠及不同探测部位表现出不同的特性,其对于MDA-MB-231荷瘤鼠体内肿瘤的灵敏度显著高于MCF7荷瘤鼠,且病灶部位和腹部的SPE光强信号较左侧及背部更敏感于体内肿瘤的生长。对于MDA-MB-231荷瘤鼠来说,其肿瘤处于早期时(r<0.5 cm),体表SPE光强信号已显著区别于健康对照鼠,即使是在病灶部位尚未出现显著的形态学变化时,并且随着肿瘤的不断发展,其体表SPE光强信号与健康对照鼠的差异逐渐加大;而对于MCF7荷瘤鼠而言,其体表SPE光强信号只有在肿瘤发展到一定阶段时才表现出与对照鼠的显著差异,在肿瘤发展的早期,差异不显著。3.当肿瘤发生转移时,荷瘤鼠体表的SPE光强信号的整体特征参数也可能发生显著性的变化,不同于未发生肿瘤转移的荷瘤鼠和健康对照鼠,但仍需进一步的实验验证。第四部分乳腺癌荷廇鼠体表SPE信号特性与体内代谢的相关性研究1.对于两种不同类型荷瘤鼠体表不同探测部位的SPE光谱特征参数与血清中4种代谢相关指标的相关性而言,血清中的H202和MDA的含量主要与体表4个不同探测部位光谱特征参数中的SP1和SP3显著正相关,且不同探测部位的相关性强弱不同,另外,荷瘤鼠血清中H202和MDA会根据探测部位及肿瘤种类的不同,选择性的影响体表SPE光谱特征参数中的SP2、SP4及SP6;血清中SOD的活性主要与体表4个不同探测部位的SPE光谱特征参数中的SP2和SP5密切相关,并且,不同类型荷瘤鼠在不同探测部位的相关性不同;而血清中T-AOC与体表光谱特征参数的相关性在不同类型荷瘤鼠中表现出较大的差异:MDA-MB-231荷瘤鼠血清中的T-AOC主要影响体表光谱特征参数中的SP2、SP4和SP5,而MCF7荷瘤鼠血清中的T-AOC主要影响体表光谱特征参数中的SP1、SP2和SP3,并且,不同探测部位受影响的光谱特征参数不同。2.肿瘤组织的血管生成状态也会选择性的影响体表不同的光谱特征参数,而且,不同类型的肿瘤对光谱特征参数的影响不同。说明荷瘤鼠体表的SPE光谱不仅与血清中氧化和抗氧化物质具有相关性,还会在一定程度上受肿瘤组织中血管生成状态的影响。3.对于荷瘤鼠体表SPE强度信号特征参数与血清中4种代谢相关指标及肿瘤组织中微血管密度的相关性而言,无论是MDA-MB-231荷瘤鼠,还是MCF7荷瘤鼠,其体表4个部位的SPE强度信号特征参数IP1均与血清中H2O2和MDA含量以及肿瘤组织中微血管密度密切相关;而血清中抗氧化酶类SOD活性和T-AOC主要与荷瘤鼠体表SPE强度信号特征参数中的IP2和IP3相关,但是不同类型荷瘤鼠之间存在差异。研究结论1.与荷兰Meluna研究所合作完成了两套生物光子探测系统的组装,并根据实验要求对两套探测系统进行了相应的测试,使两套探测系统的稳定性、灵敏度和信噪比均达到最佳,通过预实验确定了裸鼠麻醉所需麻醉剂的剂量和实验前所需的暗适应时间,为后续实验做好铺垫。2.通过对两种不同分子类型荷瘤鼠体表不同探测部位的SPE光谱在乳腺癌的发生、发展及转移过程中的动态变化特点进行分析,结果表明,两种不同类型荷瘤鼠体表的SPE光谱对体内肿瘤的生长都十分敏感,即使是在病灶部位尚未出现显著的形态学变化时,并且,随着体内肿瘤生长状态的不同而发生改变;两种不同类型荷瘤鼠体表的光谱分布在肿瘤的各个不同生长阶段之间均存在显著的差异,且光谱信号对于MDA-MB-231荷瘤鼠体内肿瘤的灵敏度高于MCF7荷瘤鼠;当肿瘤发生转移时,荷瘤鼠体表的SPE光谱特征可能也会发生改变,尤其是病灶部位和腹部,但结果有待进一步验证。这提示我们,SPE光谱包含一定的与体内肿瘤病理状态相关的信息,经过后续进一步的研究,也许可以作为一种新颖的、无创的生物物理指标用于乳腺癌的研究,尤其是在恶性乳腺癌的早期阶段。3.通过对两种不同类型荷瘤鼠、不同探测部位体表的SPE光强信号在乳腺癌的发生、发展及转移过程中的动态变化特点进行统计分析,结果显示,荷瘤鼠体表的SPE光强信号同样敏感于体内肿瘤的生长,且随着肿瘤的发展表现出一定的规律性;SPE光强信号对MDA-MB-231荷瘤鼠体内肿瘤的灵敏度也高于MCF7荷瘤鼠,且病灶部位和腹部的SPE信号较左侧及背部更敏感于体内肿瘤的生长;当肿瘤发生转移时,荷瘤鼠体表的SPE光强信号可能也会发生改变。表明荷瘤鼠体表的SPE光强信号同样包含一定的与体内肿瘤病理状态相关的信息。4.通过对两种不同类型荷瘤鼠血清中的4种代谢相关指标(H2O2、MDA、SOD及T-AOC)以及肿瘤组织中的微血管密度标志物CD31表达量与体表不同探测部位的SPE光谱和光强信号特征参数进行相关性分析,结果表明,两种不同类型乳腺癌荷瘤鼠血清中的代谢相关指标和肿瘤组织中的微血管密度会选择性的与不同探测部位体表的SPE光谱或光强信号特征参数呈现一定的相关性,而且,不同类型荷瘤鼠之间存在差异。这些结果进一步说明,裸鼠体表的SPE信号,无论是光谱信号还是光强信号,均与体内代谢密切相关,包含丰富的与体内肿瘤代谢相关的信息,具有从整体上反映体内肿瘤病理代谢状态的潜能。通过对体表SPE信号和体内不同种类肿瘤病理状态的进一步研究和分析,寻找不同肿瘤以及肿瘤与其他疾病之间的生物光子的特异性,SPE也许可以作为一种无创的、可实时反映体内病理状态的生物物理指标用于肿瘤的研究,尤其是在恶性肿瘤的早期阶段。创新点与意义1.首次在动物水平上系统研究了在乳腺癌发生、发展过程中,荷瘤裸鼠体表SPE光谱和光强信号的变化特点,并获得了可表征光谱和光强信号特性的特征参数,弥补了 SPE在肿瘤方面研究的不足,为SPE用于肿瘤的研究提供了方法和数据支持。2.首次探讨了肿瘤发生转移后,荷瘤鼠体表SPE光谱和光强的变化,尽管实验结果有待进一步验证,但为肿瘤转移无损检测的研究提供了新视角。3.首次研究了肿瘤发展过程中荷瘤鼠体表的SPE光谱和光强信号与体内代谢相关物质以及肿瘤组织中微血管密度的相关性,用数据证明了 SPE与体内代谢状态的相关性。