Micro RNA(mi RNA)是一类大小约为22个核苷酸的内源性短非编码RNA,广泛存在于动植物体内,通常结合机体内靶m RNA 3’非编码区(3’UTR)从而抑制m RNA的翻译进而对基因表达起负调控作用。根据mi RNA在基因组上与其它转录单位的位置关系,mi RNA可分为基因间mi RNA(intergenic mi RNAs)和基因内mi RNA(intragenic mi RNA),而后者包括蛋白质编码基因的外显子或内含子mi RNA。目前,尽管在动物和植物中对mi RNA功能研究已经揭示的很清楚了,但对mi RNA基因自身的转录了解仍十分有限,而对位于基因内的mi RNA及其与宿主基因的转录关系,更是知之甚少。本实验室前期对mi R-135a在脂肪生成的作用和功能进行了探索研究,但mi R-135a在脂肪生成过程中的本身转录机制并不清楚。因此,本研究采用生物信息学预测、启动子双荧光素酶报告基因载体、点突变、EMSA、Ch IP、Ch IP-q PCR、q-PCR和western blot等实验技术对mi R-135a-1/2的转录机制进行了研究,主要研究结果如下:1.mi R-135a-1与mi R-135a-2位于宿主基因内根据NCBI网站比对发现,mmu-mi R-135a-1位于Chr9上Glyctk基因的第4或第5个外显子区,mmu-mi R-135a-2位于Chr10上Rmst基因的第12个内含子区。由此表明mi R-135a-1和mi R-135a-2都是基因内mi RNA。2.基因内mi R-135a-1和mi R-135a-2独立转录采用了生物信息学预测mi R-135a-1/2上游潜在的启动子,进而利用分段缺失构建启动子双荧光素酶报告基因载体,瞬时转染到3T3-L1、C3H10T1/2和BHK三种细胞中,根据双荧光素酶活性检测确定核心启动子片段。再用相应的生物学网站预测此片段中潜在的转录因子,构建点突变质粒,转染到3T3-L1细胞中,鉴定是否为核心转录因子,进而用EMSA和Ch IP试验验证转录因子与启动子是否结合。试验结果表明,mi R-135a-1上游(-1128~-557 bp)和mi R-135a-2上游(-2264~-1733bp)分别为核心启动子区,并且转录因子STAT5a同时结合在此核心启动子区域内。同时,点突变、EMSA和Ch IP试验结果得出STAT5a在细胞体外体内与核心启动子结合。试验证实,mi R-135a-1/2并不随着各自的宿主基因转录,而是具有自身的独立转录本。3.成脂转录因子STAT5a上调mi R-135a表达构建STAT5a的超表达质粒,瞬时转染到3T3-L1细胞中,检测mi R-135a及其靶基因APC的表达量。试验结果表明,超表达STAT5a后,mi R-135a的表达量上调,APC在m RNA水平上升但在蛋白水平下降。而干涉STAT5a后,mi R-135a的表达量下降,APC在m RNA水平和蛋白水平上升。试验表明,STAT5a上调mi R-135a的表达。4.转录因子STAT5a与mi R-135a的靶基因APC存在一个潜在的负反馈调节环路为了探索转录因子STAT5a与mi R-135a的靶基因APC之间的关系,本研究在超表达STAT5a的基础上,诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂肪细胞的过程中,检测STAT5a和APC的表达情况。试验结果得出,STAT5a和APC在m RNA水平和蛋白水平都呈现出此消彼长的趋势,而mi R-135a的表达与之前对mi R-135a的功能研究结果一样都是随着脂肪细胞诱导加深表达量一直下降的。试验结果显示,在脂肪沉积过程中,STAT5a与APC存在一个潜在的负反馈调节环路。综上所述,本研究的结论是:(1)mi R-135a-1和mi R-135a-2都是基因内mi RNA,但并不与宿主基因共转录,而是具有独立转录机制;(2)STAT5a同时结合mi R-135a-1和mi R-135a-2的核心启动子从而促进成熟mi R-135a的表达;(3)STAT5a与mi R-135a的靶基因APC在脂肪细胞分化过程中存在一个潜在的负反馈调节环路。