论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的传染性疾病之一，已造成世界养猪业巨大经济损失。GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，在动物体内可诱导产生中和抗体。因此，GP5蛋白基因是研究PRRSV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是利用RT-PCR技术把GP5基因克隆入腺病毒表达载体系统中，构建成重组腺病毒，使GP5蛋白在重组腺病毒中获得表达，为研究PRRSV重组腺病毒疫苗奠定基础。 本研究据GeneBank数据库美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列设计合成一对针对GP5基因的特异性引物，在两条引物的5′端分别含有限制性内切酶位点。用TRIZOL试剂提取国内分离PRRSV的强毒株S1感染的Marc-145细胞的总RNA，用鼠源反转录酶M-MLV反转录后进行PCR扩增。扩增出的DNA片段大小与预期的片段大小相符。PCR产物经凝胶回收纯化后同穿梭载体pShuttle-CMV同时进行KpnⅠ和XhoⅠ的双酶切，再分别经凝胶回收纯化，用T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化DH5α后，经质粒提取，PCR、酶切鉴定和基因序列分析。再用PmeⅠ或EcoRⅠ将重组质粒进行酶切线性化，完全线性化后的重组质粒用凝胶试剂盒回收。回收后的产物与腺病毒骨架载体pAdEasy-1按一定比例混合通过电转化转入大肠杆菌菌株BJ5183中，使它们在大肠杆菌BJ5183中发生同源重组。转化后的产物加入1.0ml的室温LB培养基，37℃振荡培养1.0h。然后把产物涂布于含50μg／ml的卡那霉素抗性（Kanr）的LB平板，24h后挑取平板上的最小抗性菌落，过夜培养，提取质粒，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。对约40kb质粒进行PacⅠ酶单酶切鉴定。重组后的质粒经PacⅠ酶切后有两种电泳图谱：即在起始点和右臂之间同源重组的质粒有35kb与4.5kb2个条带和在左右臂间同源重组的质粒有35kb和3kb2个条带。重组阳性质粒经提取和纯化后进行PacⅠ单酶切。经PacⅠ完全线性化后的质粒再用用酚：氯仿抽提、乙醇沉淀，无菌双蒸水溶解后，应用阳离子脂质体转染技术将线性化质粒转导入HEK293-A细胞中，37℃5％的CO2温箱培养5-7天。转染后逐日观察细胞病变，即表现细胞圆缩、聚集、拉网、脱落等细胞病变。用噬斑形成单位试验进行病毒纯化。最后通过RT-PCR、间接免疫荧光试验确定了纯化后的PRRSV GP5蛋白重组腺病毒病毒于HEK293-A细胞内获得了成功表达，构建成功PRRSV GP5蛋白的重组腺病毒，病毒的滴度为104.33TCID50／1.0ml。纯化病毒在HEK293-A细胞内连续传代三次。病毒效价稳定。证明构建成功能够稳定表达PRRSV GP5蛋白的重组腺病毒，为PRRS重组腺病毒 摘 要 疫苗的研究奠定了初步的基础。