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利福平(Rifampicin，RFP)是一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，它最大的副作用是肝损伤。本文我们将研究一种由内质网应激诱导的蛋白-中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)。它可以减弱利福平诱导的肝损伤。在利福平诱导的肝损伤的小鼠中，肝湿重比、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase， ALP)、总胆汁酸(Total bile acid，TBA)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)以及结合胆红素(Direct bilirubin，DBIL)等指标明显升高。同时，利福平诱导的肝损伤的动物模型中，MANF的蛋白和mRNA水平显著升高。我们发现造模后，与野生型(Wild type，WT)小鼠相比，肝细胞MANF特异性敲除(Hepatocyte-specific MANF knockout，HKO)的小鼠的肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL显著升高。另外，人重组蛋白MANF(Recombinant human MANF， RhMANF)的治疗可以有效减轻利福平造模导致的肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL的升高。TUNEL染色检测发现与WT相比，造模后的HKO动物中凋亡细胞增加。同时凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein， CHOP)，增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和增殖蛋白Ki67的蛋白水平和Ki67的mRNA水平也在造模之后升高。与WT相比，造模后的HKO动物中这几个蛋白水平也是显著上升的。rhMANF蛋白同样可以拯救细胞凋亡，减弱CHOP、PCNA和Ki67的升高。在造模后的HKO小鼠中，能够帮助蛋白质转运和加工的免疫球蛋白重链结合蛋白质(Immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP)和激活转录因子4(Activating transcription factor 4， ATF4)升高明显，rhMANF蛋白可以减弱这种影响。因此，我们得出结论：肝细胞的MANF通过抑制ATF4-CHOP信号通路减弱利福平诱导的肝损伤。
1.MANF在利福平处理的小鼠的肝脏中上调表达
为了研究利福平诱导的肝损伤是否会影响MANF的表达，300mg/kg利福平每天同一时间对C57BL/6野生型雄性小鼠灌胃，2周后动物在最后一次灌胃的6小时后处死动物。阴性对照组用等体积的溶剂羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)处理。结果发现，造模后WT动物肝脏中的MANF的蛋白水平和mRNA水平显著升高。与对照组相比，造模组小鼠的肝脏出现黄染，并且体积变大。肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL升高明显。这些结果提示利福平诱导的肝损伤动物模型构建成功，MANF在模型中表达升高。
2.肝细胞的MANF敲除加重利福平诱导的肝损伤
为了探讨MANF上调在利福平引起的肝损伤中的作用，肝细胞的MANF特异性敲除的小鼠被用作动物模型，HKO小鼠肝脏中的MANF表达显著降低，但是在肝脏大小、体积和肝功能并无明显变化。然而，与WT造模组相比，造模后的HKO动物中肝湿重比，ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL升高明显。而且，HKO造模组的肝脏病理情况更为严重。这些结果提示，肝细胞的MANF敲除可以加重利福平诱导的肝损伤。
3.rhMANF蛋白能够减弱利福平诱导的肝损伤
为了验证MANF对利福平诱导的肝损伤的保护作用，连续两周每周一次在给予利福平处理后的6小时尾静脉注射给予WT小鼠和HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白(5，10和20μg)。给予rhMANF蛋白治疗之后，与模型组比较，肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL都有所降低。减弱肝损伤效果最有效的rhMANF蛋白剂量是20μg。HE染色显示rhMANF蛋白可以减弱利福平诱导的肝损伤。
4.MANF缺失促进利福平诱导的凋亡
TUNEL检测造模后WT小鼠的肝脏的肝细胞凋亡增多。与WT造模组相比，HKO造模组细胞凋亡增加明显。同样，凋亡蛋白CHOP与TUNEL结果一致，造模后WT小鼠肝脏的CHOP蛋白增多，免疫组化结果提示CHOP入核也增加。这些结果提示MANF缺失促进利福平诱导的凋亡。
5.rhMANF蛋白拯救在利福平导致的肝损伤中MANF缺失引起的细胞凋亡
尾静脉注射利福平处理后的HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白，与HKO模型组相比，TUNEL阳性点显著降低。同时CHOP的蛋白水平和mRNA水平显著降低，这些结果提示MANF能够减弱利福平引起的细胞凋亡。
6.MANF缺失促进利福平诱导的增殖
为了探究MANF对利福平引起的细胞增殖的影响，用增殖指标PCNA和Ki67检测。利福平处理之后，WT小鼠肝细胞的PCNA和Ki67入核增多。与WT造模组相比，HKO造模组肝脏中肝细胞PCNA和Ki67入核增加明显，Ki67的mRNA水平和PCNA蛋白水平增加，且有显著性意义。这些结果提示MANF缺失促进利福平诱导的增殖。
7.rhMANF蛋白拯救在利福平导致的肝损伤中MANF缺失引起的细胞增殖
尾静脉注射利福平处理后的HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白，与HKO模型组相比，肝细胞PCNA和Ki67入核显著降低，Ki67的mRNA水平和PCNA蛋白水平较少，且有显著性意义。这些结果提示MANF能够减弱利福平引起的细胞增殖。
8.MANF抑制利福平诱导的肝损伤中ATF4的表达
利福平可以增加BIP、ATF4和CHOP的水平，但是不会影响其它两条通路ATF6和XBP1。与WT造模组相比，HKO小鼠的ATF4蛋白和mRNA水平升高，且有显著性意义。rhMANF蛋白可以保护HKO小鼠中利福平诱导的ATF4的上调表达。为了证明MANF能对ATF4有直接的调控作用，在HepG2细胞中转染含有ATF4的不同片段大小的启动子序列的质粒，加了FLAG-MANF之后发现，与加入空载体FLAG相比，报告基因的荧光强度降低。这些结果提示MANF可以调节ATF4的转录。
根据以上研究结果，本文得出以下结论：肝细胞的MANF通过抑制ATF4-CHOP信号通路保护利福平诱导的肝损伤。
1.MANF在利福平处理的小鼠的肝脏中上调表达
为了研究利福平诱导的肝损伤是否会影响MANF的表达，300mg/kg利福平每天同一时间对C57BL/6野生型雄性小鼠灌胃，2周后动物在最后一次灌胃的6小时后处死动物。阴性对照组用等体积的溶剂羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)处理。结果发现，造模后WT动物肝脏中的MANF的蛋白水平和mRNA水平显著升高。与对照组相比，造模组小鼠的肝脏出现黄染，并且体积变大。肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL升高明显。这些结果提示利福平诱导的肝损伤动物模型构建成功，MANF在模型中表达升高。
2.肝细胞的MANF敲除加重利福平诱导的肝损伤
为了探讨MANF上调在利福平引起的肝损伤中的作用，肝细胞的MANF特异性敲除的小鼠被用作动物模型，HKO小鼠肝脏中的MANF表达显著降低，但是在肝脏大小、体积和肝功能并无明显变化。然而，与WT造模组相比，造模后的HKO动物中肝湿重比，ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL升高明显。而且，HKO造模组的肝脏病理情况更为严重。这些结果提示，肝细胞的MANF敲除可以加重利福平诱导的肝损伤。
3.rhMANF蛋白能够减弱利福平诱导的肝损伤
为了验证MANF对利福平诱导的肝损伤的保护作用，连续两周每周一次在给予利福平处理后的6小时尾静脉注射给予WT小鼠和HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白(5，10和20μg)。给予rhMANF蛋白治疗之后，与模型组比较，肝湿重比、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL都有所降低。减弱肝损伤效果最有效的rhMANF蛋白剂量是20μg。HE染色显示rhMANF蛋白可以减弱利福平诱导的肝损伤。
4.MANF缺失促进利福平诱导的凋亡
TUNEL检测造模后WT小鼠的肝脏的肝细胞凋亡增多。与WT造模组相比，HKO造模组细胞凋亡增加明显。同样，凋亡蛋白CHOP与TUNEL结果一致，造模后WT小鼠肝脏的CHOP蛋白增多，免疫组化结果提示CHOP入核也增加。这些结果提示MANF缺失促进利福平诱导的凋亡。
5.rhMANF蛋白拯救在利福平导致的肝损伤中MANF缺失引起的细胞凋亡
尾静脉注射利福平处理后的HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白，与HKO模型组相比，TUNEL阳性点显著降低。同时CHOP的蛋白水平和mRNA水平显著降低，这些结果提示MANF能够减弱利福平引起的细胞凋亡。
6.MANF缺失促进利福平诱导的增殖
为了探究MANF对利福平引起的细胞增殖的影响，用增殖指标PCNA和Ki67检测。利福平处理之后，WT小鼠肝细胞的PCNA和Ki67入核增多。与WT造模组相比，HKO造模组肝脏中肝细胞PCNA和Ki67入核增加明显，Ki67的mRNA水平和PCNA蛋白水平增加，且有显著性意义。这些结果提示MANF缺失促进利福平诱导的增殖。
7.rhMANF蛋白拯救在利福平导致的肝损伤中MANF缺失引起的细胞增殖
尾静脉注射利福平处理后的HKO小鼠不同剂量的rhMANF蛋白，与HKO模型组相比，肝细胞PCNA和Ki67入核显著降低，Ki67的mRNA水平和PCNA蛋白水平较少，且有显著性意义。这些结果提示MANF能够减弱利福平引起的细胞增殖。
8.MANF抑制利福平诱导的肝损伤中ATF4的表达
利福平可以增加BIP、ATF4和CHOP的水平，但是不会影响其它两条通路ATF6和XBP1。与WT造模组相比，HKO小鼠的ATF4蛋白和mRNA水平升高，且有显著性意义。rhMANF蛋白可以保护HKO小鼠中利福平诱导的ATF4的上调表达。为了证明MANF能对ATF4有直接的调控作用，在HepG2细胞中转染含有ATF4的不同片段大小的启动子序列的质粒，加了FLAG-MANF之后发现，与加入空载体FLAG相比，报告基因的荧光强度降低。这些结果提示MANF可以调节ATF4的转录。
根据以上研究结果，本文得出以下结论：肝细胞的MANF通过抑制ATF4-CHOP信号通路保护利福平诱导的肝损伤。