糖尿病胃轻瘫大鼠Cajal间质细胞和平滑肌功能变化及机制

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30-50%的糖尿病患者常发生胃神经肌肉功能不全,即糖尿病胃轻瘫。糖尿病胃轻瘫临床上主要表现为早饱、上腹不适、恶心、发作性呕吐和体重减轻,严重地影响了患者的生活质量,并削弱了血糖的调控,可引起营养不良和水电解质紊乱。糖尿病胃轻瘫的原因是多方面的,现已明确胃肠运动不协调、胃顺应性降低、胃电节律异常及某些胃肠激素与糖尿病胃轻瘫的发病有密切关系,但确切的病理生理学基础尚不完全清楚。胃肠道运动形式在很大程度上取决于其内在的电活动,慢波是胃肌电活动的起步电位,决定胃肠平滑肌收缩的节律,调控着胃肠运动发生的时间、地点、频率和方向。因此,可以说慢波是胃动力的基础。位于肠肌丛和环行肌粘膜下边缘的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)是胃肠慢波活动的起搏细胞和传导者。在胃肠平滑肌内,ICC主要分布于肠肌丛、黏膜下丛以及深肌丛,它们形成一3-5个细胞厚的薄细胞层,其细胞突起以缝隙连接互相形成ICC网络并与平滑肌联系,ICC不仅可作为节律性电活动的起搏器参与电活动的传播,而且是肠神经系统调控肌活力的中间媒介。肠肌丛ICC与运动神经元相联系,接受和传导神经信号,ICC自发活动的产生和传播受到离子环境、神经递质和激素等生物活性物质的影响。线粒体是细胞能量转换的细胞器,在维持细胞正常的能量代谢、结构和功能方面具有重要作用。当细胞内、外环境发生变化时,线粒体的结构、功能将发生改变,这种变化不仅会引起整个细胞病变,而且也会导致肌体疾病的发生。有关线粒体与疾病的关系已逐步引起人们的关注,如因骨骼肌细胞线粒体缺少某些酶引起的线粒体肌病,克山病其实也是一种心肌线粒体病。同时,线粒体本身有其自身的遗传物质-mtDNA (mitochondrial DNA,mtDNA),mtDNA为一16596bp的闭环双链DNA分子,编码参与氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)过程的13种多肽,细胞通过OXPHOS产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90%以上。因线粒体DNA因缺乏组蛋白保护,损伤修复系统不健全,易遭受氧化物等损伤因子的攻击而发生突变,容易成为各种攻击因子的靶点。 <WP=11>mtDNA的主要作用是编码与线粒体呼吸链相关的蛋白亚单位,细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是位于线粒体内膜上呼吸链末端的限速酶,是唯一能将电子传给氧分子的细胞色素复合物,属亚铁血红素—铜氧化酶的超家族(COX和辅酶Q氧化酶),其利用从亚铁细胞色素C传来的电子催化氧的四个电子还原,并产生质子电化学电位梯度(△μH),同时把氧化还原反应中的能量通过OXPHOS转变为含高能磷酸键的ATP,在能量产生中起主要作用,是线粒体氧化能力的关键调节部位, 在细胞有氧代谢和OXPHOS偶联中起着重要作用,被称为需氧生命的能量发生器。在真核细胞中,该酶作为一种跨膜整合蛋白存在于线粒体内膜上,所有哺乳动物真核细胞中CO有13个亚基组成,其中最大的三个亚基(COI、COII、和COIII)来源于线粒体,COII位于线粒体胞浆面与细胞色素C 进行反应,COIII参与氧化还原连接的质子过程,其余十个亚基是由核编码,有明显的种族和器官特异性,它们的功能还不甚清楚,可能起某种调节作用。最近研究已显示线粒体在胃肠道起搏电活动中有重要作用,Takayama等研究发现在W/Wv缺陷大鼠IC-MY的缺乏与细胞色素氧化酶VII亚基下调有关,胃肠道平滑肌细胞与Cajal间质细胞内线粒体呼吸链是胃肠道动力功能发挥的重要物质基础,Cajal间质细胞内丰富的线粒体为慢波产生提供了足够的能源,Cajal间质细胞与平滑肌之间存在的缝隙连接又为电流传导提供了方式。Cajal间质细胞产生的起搏电流依赖内质网和线粒体的Ca2+摄取,Cajal间质细胞网络构型变化以及线粒体形态和功能的改变,可能为糖尿病胃肠道功能紊乱的一个重要病因,值得进一步研究。胃的电起搏和动力神经传递依赖Cajal间质细胞(ICC)网络的功能,ICC有丰富的线粒体为慢波产生的能源,细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的关键酶,其损伤可直接影响线粒体功能,线粒体DNA在损伤因子的攻击下易发生突变,可能成为胃节律紊乱的靶点。在临床中很多胃肠功能紊乱性疾病无明显的器质性病变,主要为慢波节律与收缩功能的变化,ICC网络的异常可能是其发生的病理生理学基础,而线粒体形态和功能改变以及线粒体编码与呼吸链相关基因的变化在其中起重要作用。为此,本研究利用糖尿病大鼠建立胃节律紊乱模型,采用免疫组化激光共聚焦显微镜、RT-PCR等技术评价胃壁ICC网络构型变化、平滑肌线粒体膜电位和线粒体编码基因细胞色素 C氧化酶I、II、III变化规律;TUNEL法和流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI双标检测凋亡细胞;紫外分光光度法检测CO活性;Westrn blot分析c-kit、caspase3、Bax、bcl-2、cyt C蛋白变化,探讨ICC和平滑肌改变在糖尿病大鼠胃轻瘫发生中的作用。 <WP=12>一、糖尿病大鼠胃肠道动力改变及Cajal间质细胞网络构型变化1.糖尿病大鼠胃肠道动力变化:糖尿病大鼠胃内色素相对残留率(134.38±21.25%)与正常对照组(100.00±16.46%)比较显著增加;糖尿病大鼠小肠传输速度(23.57±11.15%)与正常对照组(57.23±13.58)比较明显减慢(P<0.01)。表明糖尿病可出现明显的胃肠道动力功能障碍。2.糖尿病大鼠浆膜下胃电活动:正常组大鼠慢?
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