论文部分内容阅读
食管癌是常见的恶性肿瘤之一,中国是世界上食管癌高发国家、也是世界上食管癌高死亡率的国家之一,河南省是食管癌的高发省份。目前的治疗方法对中、晚期食管癌而言,疗效均不太满意,并有一定的局限性,因此寻找新的更有效的治疗食管癌的方法,已成为近年来的研究热点之一。桩蛋白(paxillin)是近年来发现的一种重要的细胞黏附因子,是致瘤性酪氨酸激酶的一种底物,与整合素相关联,构成细胞与细胞外基质局部黏附关键部位,调节细胞的移动和播散等功能,从而提高肿瘤细胞转移和侵袭的能力。Paxillin作为一种信号接头蛋白,在多种细胞外刺激引起的信号传导中发挥作用。研究表明paxillin有参与动态调节黏着斑、调节细胞的移动和播散等功能。而肿瘤的浸润和转移与细胞的黏附力、移动力的改变直接相关,提示paxillin在肿瘤细胞的浸润和转移中起着十分重要的作用。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)可特异性的抑制靶基因的表达,而不影响其他基因的正常功能,近年来已广泛用于基因研究,但在食管癌EC9706细胞中,利用ASODN抑制paxillin产生影响的研究,目前尚未见文献报道。本研究采用ASODN技术,观察不同浓度的paxillin ASODN处理食管癌EC9706细胞不同时间后,对食管癌细胞paxillin的表达抑制情况。将paxillin ASODN转染的最佳作用时间和最佳作用浓度的EC9706细胞接种于裸小鼠皮下,构建裸鼠移植瘤模型,观察各组裸鼠成瘤情况及构建的裸鼠移植瘤组织中paxillin的表达情况,为食管癌的临床靶向治疗提供实验依据。材料和方法1.人食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤研究所赠送。2. EC9706细胞分组培养：将对数生长的细胞按实验设计分为不同终浓度、不同作用时间的ASODN实验组、无关序列组(N-ODN)和空白对照组进行实验分组,每组设3个复孔进行培养。3.利用Lipofecter脂质体介导,转染paxillin ASODN和N-ODN于食管癌EC9706细胞中。4. SPF级BALB/C裸小鼠15只,饲养在恒湿、恒温的裸鼠隔离器中,饲料及饮水均经灭菌处理。5.裸鼠移植瘤模型的构建：将ASODN实验组、N-ODN组和空白对照组细胞分别注入裸鼠左下肢皮内,在恒湿、恒温的隔离器中饲养。6.采用免疫组化PV法检测各实验组细胞和移植瘤组织中Paxillin蛋白的表达。7.采用原位杂交技术检测各实验组细胞和移植瘤组织中paxillin mRNA的表达。8.统计学处理：统计分析采用SPSS 10.0软件。计量资料用均数±标准差(X±s)表示,两组均数的比较用t检验,两组以上均数的比较用单因素方差分析；检验水准α=0.05。结果1.免疫细胞化学显示,转染paxillin ASODN的EC9706细胞随浓度或时间的增加,Paxillin蛋白的表达降低；在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L paxillin ASODN作用72h效应最强。2.原位杂交结果显示,转染paxillin ASODN的EC9706细胞随浓度或时间的增加paxillin mRNA表达降低,在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L paxillin ASODN作用72h效应最强。3.免疫组织化学显示,实验组裸鼠移植瘤组织中Paxillin蛋白的表达降低,与无关序列组和空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.原位杂交结果显示,实验组裸鼠移植瘤组织中paxillin mRNA的表达降低,分别与N-ODN组和空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1. paxillin ASODN转染后,EC9706细胞中Paxillin蛋白及paxillin mRNA的表达均降低,提示paxillin ASODN可抑制EC9706细胞中Paxillin蛋白及paxillin mRNA的表达。2.转染paxillin ASODN可抑制裸鼠EC9706细胞移植瘤组织中Paxillin蛋白及paxillin mRNA的表达；并抑制裸鼠EC9706细胞移植瘤的生长,提示利用paxillin ASODN治疗食管癌具有可行性。