麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因生物功能及其应用的研究

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从麦迪霉素产生菌-生米卡链霉菌1748中克隆到酮基还原酶基因,基因序列分析表明该基因与Ⅱ型酮基还原酶基因actⅢ和dauB相似,该基因可以互补不同长度聚酮体的酮基还原酶基因,基因中断(gene disruption)实验结果证明此基因参与合成的聚酮体在麦迪霉素产生菌中决定孢子色素的形成,在大肠杆菌中成功地表达了该基因,表达产物具有生物活性。该基因可与其它聚酮合成酶组合,形成新化合物。 麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红素酮基还原酶基因actⅢ同源的BamHⅠ-BamHⅠ 4.0kb DNA片段连到质粒载体pWHM3中,构建了重组质粒pCB4。以actⅢ基因为探针,经分子杂交将4.0kb DNA片段中与actⅢ同源的部分定位于BssHⅡ—BamHⅠ 1.3kb DNA片段上。将1.3kb DNA片段分别插入到质粒载体pWHM3和pIJ702中,构成了重组质粒pWX1和pWX2。将质粒pWX2转入酮基还原酶基因缺陷菌株-天兰色链霉菌TK18中,转化子恢复产生放线紫红素。将质粒pWX2转入另一个酮基还原酶基因缺陷菌株-加利利链霉菌ATCC 31671中,转化子发酵产物经TLC分析证明是阿克拉菌酮,与原株-加利利链霉菌ATCC31133的产物相同。说明质粒pWX2中插入的1.3kb DNA片段含有一个完整的麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因,该基因互补了天兰色链霉菌TK18和加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使它们分别恢复了产生放线紫红素和阿克拉菌酮的能力。放线紫红素是八酮体,而阿克拉菌酮是十酮体,麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因既可以参与放线紫红素的生物合成,又可以参与阿克拉菌酮的生物合成,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因可以参与不同长度聚酮体的生物合成。 工作中还发现在麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因上游的3.0kb DNA片段具有提高抗生素生物合成的能力。重组质粒pCB4和pWXl分别转入加利利链霉菌ATCC31671中,含pCB4转化子的阿克拉菌酮产量是含pWX1的转化子的2-3倍。将此3.0kb DNA片段连到质粒载体pWHM3中,构建了重组质粒pWX3。把pWX3和pWHM3分别转入加利利链霉菌ATCC31671中,含pWX3转化子的2-羟基阿克拉菌酮产量比含pWHM3转化子的提高了1倍。推测在麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因上游的3.0kb DNA片段中可能
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