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阿尔采默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种不可逆的原发性神经退行性疾病，主要表现为进行性记忆、学习和认知能力的丧失，主要病理特征为脑内尤其是海马和大脑皮层出现高密度老年斑（SP），神经原纤维缠结（NFTs），和大量神经元的丧失等。研究表明，SP中的主要成分是由39-43个氨基酸组成的β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，AβP）。目前，关于AβP及其片段25-35（AβP25-35）的神经毒性作用已有广泛报道。近年来的研究显示，AβP的更小片段31-35（AβP31-35）对大脑皮层、海马、基底前脑及隔核等脑区的神经元也同样具有神经毒性，可以用来分析完整AβP分子的毒性作用，虽然这一论点还需要进一步征实。 阐明AβP的神经毒作用机制无疑将对AD的治疗和预防产生重大影响。然而，关于AβP及其片段的神经毒作用的机制目前尚无定论，尽管已提出一些毒性机制的假说，如：对细胞膜原有通道的毒性作用，在细胞膜上形成新的离子通道，细胞的氧化应激损伤，以及细胞内Ca2+超载等。即便如此，在深入研究AβP神经毒作用机制方面，有关它通过影响K+通道功能并进而引致Ca2+内流，最后出现神经元兴奋性改变和细胞死亡方面，近年来受到人们的普遍关注。有资料显示，AβP及其片段可影响电压门控山西医科大学博士学位论文K斗通道，但K+电流受Aββ毒性作用的实验结果报道不一。在单通道水平上，本实验室利用内面向外（inside一out）式膜片已证实，AβP3卜35通过膜片内侧给药，可抑制大鼠海马神经元的C扩气激活大电导K+通道（BK）及延迟整流K十通道（IK），但AβP31一35对AD时另一个主要的受累部位大脑皮层神经元BK通道的作用如何，以及在全细胞水平对海马及大脑皮层神经元IK及快速失活K十通道（I^）的影响如何尚未见报道。另有资料显示，全长的AβP分子和AβP25一35片段与培养的海马神经元共同孵育后也可引起神经元胞内Ca2+升高，但其作用机制尚待阐明，因此有必要观察AβP的更小片段31一35是否也能引起Ca2+超载并进一步分析其作用机制。本研究采用单通道内面向外式膜片钳技术，观察了AβP31一35和AβP25一35对大鼠急性分离的大脑皮层细胞BK通道活动的影响;用全细胞膜片钳（whole一cell βatch clamp）技术记录了Aβp31一35和^βP25一35对急性分离的海马CAI锥体细胞I^和IK通道电流的影响;以及采用Ca2+荧光成像技术（ca，+fluoreseenee imaging），观察了^βP3z一35和^βP25一35对急性分离的海马神经元胞内C扩十水平的影响并对其形成机制进行了初步探讨。第一部分:邓β31一35和Apβ25一35抑制大鼠大脑皮层神经元BK通道的活动 大电导钙激活钾通道即BK通道广泛分布于神经元细胞膜上。在细胞发生动作电位期间，BK通道可以被膜的去极化和细胞内Ca2+水平的增高所激活，其直接效应是产生快后超极化（幼月β），在部分神经元中还进一步增强动作电位的复极化。因此，BK通道的作用主要是使神经元动作电位的时程维持在正常范围内，使神经元放电频率减少、降低神经元的兴奋性，，从而控制细胞的Ca2+内流和细胞对兴奋性氨基酸递质的反应。本实山西医科大学博士学位论文验在大鼠大脑皮层神经元内面向外式膜片上记录了BK通道的单通道活动，在确定BK通道性质的基础上，采用快速更换浸浴液的细胞灌流系统，观察了AβP31一”和AβP25一35对BK通道活动的影响。结果显示:（l）所记录通道的电活动特性符合BK通道的特点，表现为:（i）大电导，即在膜内外对称性K+（[K+]‘z[K+]。=140/140 mmol几）和非对称性K+（[K+11/〔K+1。=140/5 mmol/L）溶液情况下，单通道的平均电导分别为201土32.65βs（n=5）和l一3土18.64 ps（n==7）;（11）K+选择性，即通道电流的翻转电位在以上对称性和非对称性的K十溶液中分别为omV和一57.3士7.62mV，后者接近于K+平衡电位，而且用140mmol几的Csc!或加入20mmol几的TEA可完全阻断通道活动;（iii）电压依赖性和CaZ十依赖性，即随着膜片内侧Ca2+浓度的增加和膜片的去极化，单通道开放概率（β。）和开放频率明显增加。（2）溶液中给予5林mof/L的AβP31·35后，BK通道的平均β。和开放频率在1一3分钟内分别减少了93.39%士9.72%（n=17，p<。.01）和54.84%士34.67%（n=11，p<0.01）;平均开放开放时间从7.51士5.68 ms减少到2.71士3，43 ms，减少了54.67%士24.61%（n== 20，p<0.01），开放时I’ed常数:l和TZ分别由对照的1.25士0.84 ms和一1.69士5.34 ms减少到0.44士0.29 ms和5.65士9.77 ms（n=10，p<0.01）。（3）应用Aβp31一35后，BK通道的平均电流幅度有所减少，但无统计学意义（n=5，p>0.05）.（4）给予同样摩尔浓度的AβP25一35也引起类似的公K通道的明显抑制:平均β。减少了86.91%士26.61%（n=7，P<0.OI）;平均开放时间从4.59士1.55 ms减少到2.74士2.08ms（n=6，p<0.01），减少了54.67%士24.61%，;平均关闭时间则从5.28士 3.02:ns增加到63 .48士2209n飞s（:1=6，p<0.01），增加了90.34%士6.58%。（5）AβP3卜35和AβP25一35对BK通道的抑制作用在多数膜片中是可逆的。 本实验结果表明，AβP31一”和AβP25·35能同样快速可逆地抑制大鼠大脑皮层神经元BK通道的?