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研究背景及目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界范围内的第三大常见癌症,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。由于多数患者在发现时已处于疾病中晚期,临床上对于局部病灶外侵固定无法手术或手术无法切净的病例,通常在围手术期对肿瘤进行局部放疗处理。目前对结直肠癌进行放射治疗的主要难点在于肿瘤的放射抵抗性,极大限制了放疗在结直肠癌治疗中的应用。因此,进一步阐明结直肠癌对放疗反应的潜在机制,探索靶向调控结直肠癌放疗敏感性关键分子的治疗手段具有重要意义。近年的研究发现肝细胞癌衍生生长因子（hepatoma-derived growth factor,HDGF）与肿瘤放疗敏感性的关系密切。DNA双链断裂是电离辐射导致细胞死亡最重要的原因,而核仁素（Nucleolin,NCL）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质。研究表明Nucleolin在胞膜-胞浆-胞核中的穿梭功能对于电离辐射所致的DNA损伤修复中起着关键性作用。进一步的研究表明HDGF可以影响Nucleolin的亚细胞定位,还可与Nucleolin相互作用形成一种核蛋白复合体,可能参与DNA的损伤修复。本课题首先研究了HDGF对结肠癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响,随后通过下调HDGF的表达研究其对结肠癌细胞放疗敏感性以及Nucleolin转位和电离损伤修复的影响。以期明确HDGF是否通过与Nucleolin蛋白相互作用来调控结肠癌细胞的放射敏感性,同时进一步探讨具体的作用机制。方法:1.应用Si RNA干扰技术及慢病毒载体转染构建稳定抑制HDGF表达的结肠癌细胞,探讨抑制HDGF基因的表达对于结肠癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及迁移等生物学行为的影响。构建结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察并记录瘤体的生长情况;TUNEL法检测移植瘤瘤体组织中细胞的凋亡情况;免疫组化检测移植瘤组织中HDGF及Nucleolin的表达。2.对HDGF抑制组和非抑制组结肠癌细胞给予放射处理。通过CCK-8法及克隆形成法检测各组细胞放疗前后增殖能力的变化;采用流式细胞术检测放疗对各组细胞周期、凋亡的影响;通过划痕实验检测放射处理对各组结肠癌细胞迁移能力的影响。3.对HDGF抑制组和非抑制组结肠癌细胞给予放射处理。通过western-blot检测各组细胞HDGF及Nucleolin总蛋白的表达变化;分离提取胞浆胞核蛋白后检测HDGF及Nucleolin蛋白在胞浆、胞核中的表达变化;采用细胞免疫荧光实验检测HDGF与Nucleolin在细胞内的定位情况;通过western-blot检测各组细胞DNA损伤修复相关分子、周期相关蛋白、内质网应激及凋亡相关蛋白的表达变化。结果:1.抑制HDGF的表达后,结肠癌细胞增殖能力减弱,凋亡率增加。沉默HDGF基因能减少结肠癌细胞穿过Transwell小室的细胞数,降低结肠癌细胞划痕修复率。抑制HDGF表达可以显著抑制结肠癌细胞在体内的肿瘤形成能力,促进瘤体内细胞凋亡。2.抑制结肠癌细胞HDGF的表达后,在电离辐射作用下,细胞增殖能力进一步降低,细胞凋亡率进一步增高,划痕修复率进一步降低。抑制HDGF的表达在体外可增加结肠癌细胞的放射敏感性。3.在电离辐射作用下,随着照射剂量的增加,HDGF及Nucleolin总蛋白表达逐渐下调。HDGF及Nucleolin蛋白在结肠癌细胞胞核中的表达降低,在胞浆中表达逐渐升高。4.抑制结肠癌细胞HDGF的表达后,在电离辐射作用下DNA损伤修复因子γ-H2AX、NF-κB及p53的表达出现下调;细胞凋亡相关分子Bcl-2表达下降而Bax表达升高。抑制HDGF的表达后内质网应激相关蛋白ATF6和CHOP的表达出现上调,在电离辐射作用下,GRP78的表达出现上调。结论:沉默HDGF基因能在体内体外抑制结肠癌细胞增殖、促进其凋亡,在体外抑制结肠癌细胞的迁移能力。抑制HDGF的表达可增加结肠癌细胞的放射敏感性。在电离辐射作用下,Nucleolin随HDGF发生了胞核-胞浆的细胞内转位,HDGF/Nucleolin信号轴可能参与对结肠癌细胞放射敏感性的调控。