【摘 要】
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目的:通过研究microRNA-145-3p（miR-145-3p）、DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferase 3A,DNMT3A）的相互作用关系、调控机制,了解其在肝癌细胞中的作用,以及对肝癌细胞干性和恶性行为的影响,希望能为肝癌的诊疗提供新的思路。方法:1 使用在线工具 ULCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析肝细胞癌
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目的:通过研究microRNA-145-3p（miR-145-3p）、DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferase 3A,DNMT3A）的相互作用关系、调控机制,了解其在肝癌细胞中的作用,以及对肝癌细胞干性和恶性行为的影响,希望能为肝癌的诊疗提供新的思路。方法:1 使用在线工具 ULCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）中 miR-145 表达谱,数据来源于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,使用在线网站Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service）分析miR-145同肝癌患者预后的关联。并对15对肝癌和癌旁组织标本进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,以研究miR-145-3p在肝癌组织中的表达水平,分析比较其在肝癌和癌旁组织的表达差异情况;2使用qRT-PCR检测miR-145-3p在肝癌细胞系及正常肝细胞系的表达水平。使用慢病毒载体分别对肝癌细胞中miR-145-3p进行上调,建立稳转细胞系。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及流式细胞术检测转染效率,使用EdU试验、克隆形成试验、Transwell试验、流式细胞术检测miR-145-3p对HCC细胞系生物学功能的影响;3进一步使用成球试验、流式细胞术及裸鼠成瘤试验检测miR-145-3p对HCC细胞系干性的影响;4 利 用 miRNA 靶 基 因 预 测 网 站 miRabel（http://bioinfo.univ-rouen.fr/mirabel/）对 miR-145-3p 靶基因进行预测,选取DNMT3A作为目标靶基因进行进一步分析,使用ULCAN和Kaplan-Meier Plotter分析DNMT3A在HCC中的表达以及预后关联,并使用蛋白免疫印迹试验（westernblotting）及qRT-PCR检测DNMT3A在HCC组织、细胞中蛋白质、mRNA的表达,使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-145-3p与DNMT3A的靶向关系;5在miR-145-3p稳转细胞株中进行DNMT3A回复实验,检测DNMT3A能否逆转miR-145-3p介导的干性抑制效应;6寻找DNMT3A下游靶基因,检测其mRNA、蛋白质表达,及基因启动子区域甲基化情况。结果:1 miR-145在HCC组织中低表达,且低水平的miR-145表达与更差的临床预后相关;2 miR-145-3p在肝癌组织和细胞系中均为低表达,转染miR-145-3p能显著抑制HCC细胞系的增殖、克隆形成、迁移、侵袭,并能造成细胞周期停滞,加强凋亡;3 miR-145-3p能显著抑制HCC细胞系的成球能力,减少CD133+CD44+细胞比例,表明miR-145-3p能抑制HCC的干性;4 DNMT3A是miR-145-3p的直接靶基因,在HCC中表达DNMT3A能逆转miR-145-3p介导的干性抑制;5 DNMT3A能造成抑癌基因DLC1、RUNX3、SOX1以及p16启动子区域异常甲基化,从而沉默其表达,而miR-145-3p抑制DNMT3A可能具有积极的保护作用。结论:MiR-145-3p是强有力的HCC抑癌基因,其在HCC组织和细胞中低表达,通过靶向DNMT3A而抑制HCC细胞干性,miR-145-3p可能成为靶向异常甲基化的新型治疗靶点,为肝癌的治疗提供新的思路。
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