草地暝围食膜蛋白的分离鉴定

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草地螟(Loxostege sticticalis L.)是我国华北、东北和西北地区农牧业生产的重要害虫,建国后,已三次暴发成灾,给农牧业生产造成了巨大的损失。由于草地螟迁飞、滞育和周期性暴发的特点,其基础研究相对比较薄弱。围食膜(PM)作为昆虫体内一道重要的物理屏障,逐渐成为害虫防治的新靶标,同时也是国内外研究的热点。本文即在构建草地螟中肠cDNA文库的基础上,利用围食膜蛋白的多克隆抗体免疫筛选来获得编码相关基因,并进行了初步的分离与鉴定。主要研究结果如下:以草地螟中肠为材料,分别采用RNeasy Mini Kit、Oligotex mRNA kit、ZAP-cDNA? synthesis kit和ZAP-cDNA? Gigapack? III Gold Cloning Kit提取草地螟幼虫中肠总RNA,分离纯化mRNA并构建了草地螟中肠cDNA表达文库。测得文库的原始滴度为3.73×106pfu/ml,蓝白斑测定重组率达99.7%,插入片段平均长度约为1.7kb。利用甜菜夜蛾围食膜多克隆抗体对草地螟中肠cDNA文库进行免疫筛选,共获得282个阳性克隆,并对其中六个蛋白进行了分离鉴定。其中LstiCBP基因在cDNA文库筛选时5′端缺少部分氨基酸序列,设计适宜的引物结合RACE技术成功克隆了基因全长,其基因序列开放阅读框长为2,403bp,GenBank登录号为FJ408730,编码了801个氨基酸,其中15个氨基酸组成信号肽,蛋白前体分子量为86.2kDa,含8个几丁质蛋白结合功能域CBD,利用pET30载体成功进行原核表达,在围食膜、中肠组织、血淋巴、体壁以及蜕皮等组织均可检测到LstiCBP的存在,但以中肠中的含量最高,M2R能够影响围食膜中LstiCBP的含量;Lsti99和Lsti201在国内外尚属首次发现,在GenBank中不能检索到相似序列,但是在草地螟的头部、围食膜、中肠组织、血淋巴以及体壁等组织检测到了此类蛋白的存在。其中Lsti99基因GenBank登录号为FJ798745,开放阅读框长为1 245 bp,编码415个氨基酸,蛋白前体分子量为47.1 kDa,存在17个氨基酸的信号肽,通过pET30载体在大肠杆菌中成功表达了Lsti99蛋白,尽管此蛋白含有his-tag,但是并不能用镍柱进行纯化;通过GatewayTM技术将Lsti99序列重组到V5-His6标记杆状病毒,得到具有独立转染活性的重组杆状病毒,转染Sf9细胞后成功进行了蛋白的表达。Lsti201基因GenBank登录号为FJ798746,开放阅读框长2 145 bp,编码715个氨基酸,蛋白前体分子量为80.5 kDa,存在17个氨基酸的信号肽,含有59个明显的结构功能域,其中包括1个苏氨酸富集区,通过pET30进行了蛋白的表达;LstiSLC25蛋白为典型的运载蛋白,其基因开放阅读框(ORF)长897 bp,编码299个氨基酸;其蛋白质分子量为32.1 kDa,等电点为9.46,实现了蛋白在原核细胞的表达。羧肽酶为中肠重要消化酶,LstiCPA基因GenBank登录号为EU924506,全序列为1 380 bp,编码434个氨基酸,蛋白前体分子量为49.1 kDa,由信号肽、前肽和酶体三部分组成,具有羧肽酶的典型特征,原核表达后检测酶活力为0.0005 U/mL;羧酸酯酶是中肠主要的解毒酶,LstiCarE基因GenBank登录号为EU339106,开放阅读框长1875 bp,编码625个氨基酸,蛋白前体分子量为69.0kDa,具有羧酸酯酶的典型特征,蛋白在大肠杆菌中获得表达。围食膜含有至少19种蛋白质,分子量在94kDa以下,幼虫取食添加光增白剂(M2R)的食物可影响其围食膜中蛋白的种类和含量;正常的围食膜表面光滑致密、无孔洞和缝隙,幼虫取食光增白剂后其围食膜产生了孔洞,随光增白剂浓度的增加和取食时间的延长,则加重对其围食膜结构的破坏;食物添加光增白剂后能够显著缩短Bt对草地螟幼虫的杀虫时间,降低了Bt的使用浓度。通过草地螟中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为明确草地螟围食膜的靶标蛋白的生理功能提供了研究基础,通过探讨PM与病原微生物相互作用的机理,寻找生物防治新靶标,为开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。
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