目的 本研究首次用HCMV AD169株感染BALB／c小鼠，建立HCMV AD169株潜伏感染的老龄BALB／c小鼠病理学模型，为HCMV潜伏感染及其再激活机制的研究提供一个实验平台，同时探讨HCMV IE及UL83基因在病毒潜伏及再激活中作为标志基因的可能性。方法 首先通过预实验从细胞水平和分子水平对病毒进行定量测定。(一)建立敏感可靠的检测病毒颗粒的定量方法：(1)用空斑形成试验测定病毒悬液中感染性HCMV颗粒数量；(2)从病毒悬液中提取DNA，采用实时荧光定量PCR检测病毒基因拷贝数。(3)分别用50μl 0.01、0.1、1和10PFU的病毒悬液感染HF细胞，观察HCMV特征性细胞致病变效应(CPE)。观察周期结束后，将所有细胞消化，提取mRNA，经RT-PCR检测HCMV IE转录产物。(二)取6～8周龄SPF(Specific Pathogen Free)级BALB／c小鼠24只，分为2组，每组12只，分别用1×10~7PFU／ml、1×10~5PFU／ml 2个剂量的病毒悬液腹腔注射小鼠，每只小鼠注射1ml。屏蔽系统内饲养观察1年后检测小鼠脑、肺组织中有无感染性病毒颗粒及其组织病理损害情况，确定建立潜伏感染的最佳病毒剂量。在预试验基础上，建立HCMV AD169株潜伏感染老龄BALB／c小鼠病理学模型：取6～8周龄SPF级BALB／c小鼠24只，实验组(A组)12只，腹腔注射1×10~5PFU／ml病毒悬液，每只1ml。阴性对照组(B组)12只，同时同样腹腔注射DMEM液1ml。经饲养观察1年后，各组小鼠半数(6只)处死，剩余一半(6只)进行免疫抑制干预，按150mg／kg的剂量给各组小鼠腹腔注射环磷酰胺，每隔6天注射一次，共安徽医科大学硕卜学位论文3次，诱导潜伏HCMV的再激活。在最后一次注射后的第6天宰杀小鼠。饲养期间，观察小鼠一般行为。处死小鼠后，取小鼠血清检测HCMV特异性IgG抗体。取脑及肺组织进行如下试验:(1)病毒分离:接种HF细胞，观察4一sw。按预试验确定的敏感方法检测小鼠脑及肺组织中有无感染性病毒颗粒存在。(2) HE染色观察小鼠脑及肺组织的病理改变。(3)用HCMV pp65蛋白多克隆抗体进行免疫荧光检测小鼠脑及肺组织中 pp65蛋白的表达。(4)原位杂交定位检测HCMVIE及UL83基因。(5)PCR及Rl’- PCR检测小鼠脑及肺组织中HCMV IE、UL83基因及其相应的转录产物。(6)透射电镜下观察小鼠脑及肺组织的超微结构及病毒颗粒。 (7)实时荧光定量PCR检测小鼠脑及肺组织中的病毒载量。结果(一)建立了高灵敏度的检测病毒颗粒的方法。当HCMV病毒悬液病毒量为3.5 x 107PFU/ml时，基因组拷贝数为8.75 x logcoPies/ml。由此推算出IPFu病毒对应于250基因拷贝数。将病毒悬液稀释后接种HF细胞，4w内观察到IPFU的病毒可使90%HF细胞产生CPE，而0.01 PFU的病毒接种HF细胞后，没有CPE出现，提取所有染毒细胞的mRNA，在0.01PFU一10PFU/ml的滴度下，均可以检测出HCMVIE转录产物，这代表着HCMV处于复制状态，其检测的下限0.01PFU相当于2.5基因组拷贝，而建立复制性感染最少需要1基因组拷贝。(二)lx107PFu/ml病毒悬液感染小鼠后，肺组织中检测出感染性病毒颗粒，脑及肺组织均有明显的组织病理学变化;1 x lo5PFu/ml病毒悬液感染小鼠后，脑、肺中检测不出感染性病毒颗粒且无明显组织病理学变化。由此确定建立潜伏感染的最适感染剂量为IX105PFU/ml。小鼠染毒1年后，各项检测结果如下:(l)病毒分离:激活前，各组小鼠脑、肺组织病毒分离阴性;激活后，在A组小鼠的脑、肺组织中检出感染性病毒颗粒，B组小鼠病毒分离结果阴性。(2) HE染色:激活前，A组小鼠肺部无明显组织病理改变，脑部可见轻微神经元周围纤维样缠结。激活后可见肺泡壁增厚、水肿，有明显急性炎症反应，可观察到巨细胞病毒特征性包涵体。脑组织中神经元明显退行性变，神经元变性、坏死，周围纤维样缠结严重。(3)A组小鼠激活前，在脑、肺组织中pp65荧光信号均阴性;激活后，在脑、肺组织中均可见苹果绿色阳性荧光信号，主要位于胞质中。(4)用DIG标记的HCMVIE及UL83安徽医科大学硕七学位论文DNA寡核昔酸探针行原位杂交检测，A组小鼠激活前后在脑、肺组织中均可检测到不同程度的蓝紫色阳性杂交信号。(5) PCR及RT-PCR检测小鼠脑、肺组织中HCMVIE、UL83基因及其相应的转录产物:激活前，A组小鼠的脑、肺组织中均测出HCMVIE及UL83 DNA，但其相应的转录产物为阴性。激活后，上述两种基因及其相应的转录产物为阳性。B组小鼠所有结果均为阴性。(6)透射电镜下观察激活前A组小鼠脑、肺组织中没有病毒颗粒，但部分亚细胞结构有损伤;激活后可观察到典型的疤疹病毒样颗粒及病毒包涵体。(7)实时荧光定量PCR检测小鼠脑及肺组织中的病毒载量:激活前A组小鼠脑、肺组织中病毒载量分别为294士23eopies/10omg脑组织、9028士193 eopies/100mg肺组织;激活后A组小鼠脑、肺组织中病毒载量分别为5104士176eopies/loomg脑组织、78152士8905eopies/100mg肺组织。激活前后组织病毒载量差异有显著性。(尸<0.01)。结论(一)我们首次建立了HCMV AD169株潜伏感染的老龄BALB/。小鼠病理学模型，并提出此潜伏感染模型的暂定工作定义: (l)小鼠腹腔感染病毒后饲养观察1年或1年以上; (2)血清学检测小鼠血清中HcMV特异性