第一部分：鼓室内庆大霉素注射在外周前庭的时间和空间分布研究一、GTTR鼓室内注射后在外周前庭的时间和空间分布目的：应用庆大霉素德克萨斯红耦合物(gentamicin-conjugated Texas Red,即GTTR)鼓室内注射后观察其在外周前庭的时间和空间分布特点。方法：成年豚鼠行鼓室内GTTR(O.1mg/ml,50ul)注射一次,在注射后12h、24h、3d、7d、14d、28d处死动物,anti-Calretinin标记前庭Ⅰ型毛细胞,DAPI染核,运用激光共聚焦扫描显微镜观察GTTR在外周前庭的聚集和分布情况。并进行荧光密度半定量分析。结果：鼓室内GTTR一次性注射后在12小时即可见在外周前庭终末器官的Ⅰ型及Ⅱ型毛细胞、移行细胞、半月面细胞有明显聚集,在毛细胞中GTTR荧光颗粒主要聚集于表皮板及其下方,胞浆内可见极少量的弥散性分布；移行细胞和半月面细胞中的GTTR主要分布于核上区；暗细胞、支持细胞、半规管上皮细胞未见明显GTTR颗粒聚集。GTTR荧光颗粒在外周前庭感觉上皮3-7天聚集达到最高峰,并持续到28天荧光强度有明显的下降(P<0.05)；在移行细胞和半月面细胞至第28天仍可见明显聚集。GTTR在球囊斑的聚集分布较椭圆囊斑多,且有显著性统计学差异(P<0.05),GTTR在后半规管的分布聚集较其他两个半规管为多,但统计学无显著性差异(P>0.05)。结论：庆大霉素可聚集分布于外周前庭的感觉上皮中,其分布高峰位于3-7天,在28天有明显下降。庆大霉素在球囊斑的分布较椭圆囊斑为多。庆大霉素可以聚集分布在移行细胞、半月面细胞中。庆大霉素在暗细胞没有明显分布。二不同浓度GTTR鼓室内注射在外周前庭的分布目的：观察不同浓度的GTTR鼓室内一次性注射在半规管壶腹嵴的分布情况,从而了解不同类型的毛细胞对庆大霉素的吸收聚集特点。方法：将不同浓度的(GTTR (0.1,0.4,0.8mg/ml)行鼓室内庆大霉素注射后在庆大霉素时间分布的高峰第七天处死动物,anti-Calretinin标记前庭中央区Ⅰ型毛细胞,DAPI标记细胞核,激光共聚焦扫描显微镜进行,观察不同类型的细胞的吸收聚集情况,并进行荧光半定量分析。结果：O.lmg/mlGTTR浓度组可见庆大霉素主要分布于毛细胞的表皮板及其下方,胞浆内可见非常微弱的荧光分布,随着浓度的增加至0.4mg/ml,GTTR在中央区Ⅰ型毛细胞的分布由主要聚集于表皮板下到开始出现较多胞浆弥散性分布,至0.8mg/ml周边区Ⅰ型毛细胞也开始出现较弥散性分布,GTTR在Ⅱ型毛细胞中始终聚集于顶端未出现胞浆明显弥散性分布,统计学显示GTTR在三种类型的毛细胞中的分布有明显统计学差异(P<0.05)。GTTR在移行细胞和半月面细胞低浓度时即有分布,但并未随着浓度的增加有明显增加,也未出现胞浆弥散性分布。结论：庆大霉素在半规管感觉上皮毛细胞的分布具有从中央区Ⅰ型毛细胞到外周区Ⅰ型毛细胞,再到Ⅱ型毛细胞的浓度梯度分布特点。庆大霉素在移行细胞和半月面核上区有明显聚集,但并未随浓度增加出现胞浆弥散性分布。三、小剂量庆大霉素鼓室内注射在外周前庭的分布目的：观察小剂量的庆大霉素鼓室内一次性注射在外周前庭的分布情况,从而了解庆大霉素在前庭聚集分布特点,并与GTTR在外周前庭的分布进行对比。方法：将庆大霉素(5mg/ml)行鼓室内一次性注射第7天处死动物,Anti-Gentamicin染色,DAPI标记细胞核,激光共聚焦扫描显微镜进行,观察庆大霉素抗体染色在壶腹嵴和囊斑的荧光分布,并进行荧光半定量分析。结果：庆大霉素在感觉上皮细胞中可呈浓度梯度分布,首先分布中央型Ⅰ型毛细胞,其次为周边型Ⅰ型毛细胞,最后为Ⅱ型毛细胞。荧光半定量分析各类型细胞之间的分布有统计学差异(P<0.05),这一分布特点与GTTR相类似。庆大霉素在移行细胞、半月面细胞未见明显聚集分布,这一现象与GTTR研究结果不相同。结论：庆大霉素在壶腹嵴毛细胞的分布具有从中央区Ⅰ型毛细胞到外周区Ⅰ型毛细胞,再到Ⅱ型毛细胞的梯度分布特点。与庆大霉素抗体相比,GTTR有更高的灵敏度。第二部分庆大霉素对外周前庭损伤性研究目的：探讨庆大霉素对外周前庭壶腹嵴和囊斑的损伤情况及其分布之间的关系。方法：不同浓度庆大霉素(15,30mg/ml)行豚鼠鼓室内注射后,在第7天和28天分别处死动物,三个半规壶腹嵴行冰冻切片后用anti-Calretinin标记前庭中央区Ⅰ型毛细胞,anti-tencisin标记所有Ⅰ型毛细胞,DAPI标记细胞核。两个囊斑,用phalloidin-TRIRC标记纤毛。荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜扫描拍片,Image-pro-plus图像处理,SPSS进行统计学分析。结果：庆大霉素浓度15mg/ml7天组动物可见半规管中央区Ⅰ型毛细胞的神经盏有部分回缩或者完全回缩到支持细胞层,细胞核密度较正常对照组无明显差异。周边型Ⅰ型毛细胞无明显改变,庆大霉素浓度15mg/ml28天组及30mg/ml7天组可见Ⅰ型毛细胞的神经盏均回缩到基膜层；周边型Ⅰ型毛细胞无明显改变或者部分减少,中央区细胞核密度较正常减少；庆大霉素30mg/ml28天组可见中央型Ⅰ型细胞均回缩到基膜层,周边型Ⅰ型毛细胞明显减少,中央区和周边区细胞核均较正常减少形成单层感觉上皮细胞。庆大霉素注射后7天组动物,可见微纹区纤毛首先受损,球囊斑残余毛细胞较椭圆囊斑多。28天组可见球囊斑纤毛较椭圆囊斑多,球囊斑较椭圆囊斑多。结论：庆大霉素在壶腹嵴感觉上皮的损伤同分布相一致,呈现从中央Ⅰ型到周边Ⅰ型最后到Ⅱ型的梯度损伤特点。庆大霉素在囊斑的损伤同分布呈负相关,椭圆囊对庆大霉素损伤较球囊更为敏感。第三部分、豚鼠外周前庭器官体外培养GTTR的分布特点目的：观察成年豚鼠外周前庭器官体外悬浮培养时,GTTR在外周前庭器官的聚集分布特点,并与在体分布进行比较。方法：成年豚鼠椭圆囊斑和半规管分离,去除耳石和剪开壶腹嵴相对应的膜性组织后进行体外培养。培养液中加有GTTR(0.00125mg/ml),在培养后30min、2h进行观察,冰冻切片后anti-calretinin,Phalloidin,DAPI染色后运用激光共聚焦扫描显微镜观察GTTR聚集和分布情况。结果：成年豚鼠椭圆囊斑体外培养在30分钟、2小时均有较好的形态,纤毛生长良好；半规管30分钟,2小时壶腹嵴感觉上皮细胞核排列整齐。体外培养状态下GTTR在壶腹嵴感觉上皮细胞中分布同在体分布,首先分布于中央区Ⅰ型毛细胞,其次为周边区Ⅰ型毛细胞,最后为Ⅱ型毛细胞。体外培养时GTTR首先分布于球囊斑的微纹区,与在体实验相符。结论：豚鼠外周终末器官体外培养时在壶腹和囊斑的分布与体内类似。壶腹帽和耳石移动引起的细胞纤毛弯曲度的不同并不是壶腹嵴感觉上皮中央区和周边区Ⅰ型细胞的分布差异的主要原因。