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授粉是植物生长发育中一个既重要又复杂的过程,它需要花柱和花粉的正常发育以及相互作用,需要多种物质的参与和多重基因的调控。任何一个环节出现问题,都会对正常授粉造成影响。microRNA(miRNA)作为基因沉默的重要组成部分,其作用越来越受到人们的重视,已经发现它们在植物的信号转导、形态建成、花器官发育等重要的过程中发挥调控作用。但目前对于miRNA在植物授粉中的作用还知之甚少。本研究主要以玉米为材料,应用miRNA芯片和高通量测序技术,试图找到在授粉过程中发挥作用的miRNA,并对其作用进行初步研究。主要结果如下:(1)我们以玉米郑58自交系的幼嫩柱头(Im)、成熟柱头(MS)、授粉后5min柱头(PA5)、授粉后15min柱头(PA15)以及未授粉子房(UFO)为材料,通过miRNA芯片技术,得到了一系列在初始授粉过程中差异显著(FDR控制在5%以内,Fold change不低于2.0倍)的miRNA。其中,授粉后15min的柱头与授粉后5min的柱头相比,表达差异显著的miRNA最多,有126个。其余的材料中差异显著的miRNA比较少。通过比较不同样品中miRNA的表达量差异,我们得到了25个差异显著的极可能在授粉过程中发挥作用的miRNA,其中大部分为未知的预测miRNA,它们的靶基因包括ARF、HD-ZIPⅢ转录因子、AGO1以及CYP450单氧化酶的编码基因等。(2)分析结果表明miR167d可能对授粉有着重要影响。玉米和拟南芥中的MIR167D基因,在拟南芥中过量表达后都会造成转基因拟南芥植株矮小、花器官发育异常、花粉不能萌发、败育等表型。(3)通过生物信息学方法,预测了玉米中三个新的miRNA,分别为miR3171、miR3176和miR3220。将其序列与Rfam 10.0数据库中的小RNA比对,推测它不属于tRNA、siRNA等小RNA。应用茎环式Taqman Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)检测到了它们的成熟体的表达,应用RLM-RACE找到了这三个miRNA的前体,其前体的二级结构符合miRNA前体的判定标准。由此确定这三个miRNA是玉米中新的miRNA,并且它们属于同一家族。(4)选取玉米B73自交系的成熟花粉(P)、离体萌发花粉(GP)、成熟柱头(MS)、授粉后的柱头(PS)为材料,通过miRNA高通量测序,应用生物信息学方法找到了109个新的miRNA,它们的靶基因功能多种多样,能够编码甾醇合成酶、核糖体蛋白、亚精胺合成酶、富含亮氨酸的跨膜运输蛋白、微管蛋白、甲基转移酶、蛋白激酶等。这提示我们,这些新的miRNA功能非常广泛,它们可能在玉米的多个生物学过程中发挥调控作用。(5)得到miRNA高通量测序的结果后,我们采用chi2算法进行分析(以P value不大于0.01为显著差异)。发现了88个由花粉管萌发诱导产生的miRNA,其中64个为已知的,24为预测的新的miRNA;得到了48个由授粉诱导产生的miRNA,包括37个已知的和11个未知的miRNA,它们的启动子区域含有多种顺式作用元件,其靶基因包括GRF(growth-regulating factor)、GRAS家族转录因子、编码甲酯酶、漆酶的基因等。它们或来自于花粉,或来自于柱头,极可能参与了花粉与柱头的相互识别和互相作用。综上所述,本研究通过miRNA芯片技术,筛选到25个在玉米授粉过程中变化显著的miRNA,并对其靶基因功能进行了预测,其中3个为玉米中新的miRNA。通过miRNA高通量测序技术,得到了48个由授粉诱导产生的miRNA。它们很可能参与了授粉的过程,这为进一步研究miRNA在授粉中的作用提供了切入点。同时,由于miRNA在不同物种中的保守性非常高,这也为研究其它物种中miRNA的作用提供了参考。