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禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一种非常重要的传染病。它不仅能对养禽业造成严重的经济损失,而且也严重威胁着人类的健康。目前为止,疫苗是控制抗禽流感最为有效的手段。目前,商品化灭活疫苗虽然可以通过诱导产生抗体来控制禽流感病毒的感染,但由于禽流感病毒亚型和基因的不断变异,基于AIV表面蛋白的疫苗仅能提供有限的保护。因此,研发能诱导细胞免疫反应抵抗不同亚型AIV的疫苗一直是个热点问题。禽流感病毒的核蛋白(nucleo-protein,NP)和基质蛋白(matrix protein,M1)不仅在不同亚型AIV间高度保守,还具有诱导细胞免疫的能力。它们是开发具有广泛保护作用的通用型疫苗的候选抗原。本文以禽流感病毒保守蛋白NP和M1通用型疫苗为研究对象,首先,从禽流感病毒A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)中对其NP基因进行扩增、克隆和测序分析;利用分子生物学技术,构建能够融合表达H9N2亚型禽流感病毒NP基因、M1基因和树突状细胞诱导肽(DCpep)基因的原核表达载体;以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,NC8)作为表达外源基因的载体,构建重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep;使用免疫印迹方法验证融合基因在乳酸菌中的表达情况。结果显示,克隆了A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)毒株的NP全长,长度为1494 bp。构建了能融合表达该毒株NP和M1蛋白的重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep。此株重组乳酸菌表达的83 kDa融合蛋白对H9N2亚型禽流感NP单克隆抗体有良好的反应原性。其次,使用重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep与小鼠骨髓源DC共培养,利用流式细胞仪和ELISA方法检测DC表面的活化标志和细胞因子的表达水平;重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep口服免疫小鼠后,用流式细胞术分别检测小鼠PP、MLN和小肠DC的表面标志,MLN和脾脏特异性CD4+IFN-γ+或CD8+IFN-γ+的表达水平以及PP中B细胞分泌IgA和活化情况。结果表明重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep在体外能诱导小鼠骨髓源DC的B7分子活化,在体内能诱导小鼠PP和小肠DC活化。此外,口服免疫重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep,不仅能诱导小鼠产生特异性T细胞反应,还能诱导小鼠小肠B细胞活化,促进了PP中生发中心的形成,增强sIgA的分泌能力。进而,应用重组乳酸菌口服免疫小鼠,使用鼠适应性同源禽流感病毒A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)和异源流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)进行攻毒保护实验。结果显示,重组乳酸菌对感染同源禽流感病毒的小鼠能产生80%的保护率,对感染10×LD50 H1N1流感病毒的小鼠不能产生保护,但对感染0.5×LD50 H1N1流感病毒的小鼠能产生完全的保护作用。最后,为探索重组乳酸菌发挥抗禽流感病毒的作用机制,应用重组乳酸菌口服免疫小鼠,加强免疫2周后,取一部分小鼠脾脏单细胞用CFSE染色,特异性抗原刺激3d后,流式细胞仪检测小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞的增殖情况;取另一部分小鼠脾脏单细胞用流式细胞术检测CD8+CD107a+的表达水平。先用不同浓度CFSE对未免疫小鼠脾脏单细胞进行染色,然后用特异性抗原刺激脾脏细胞3 h,通过尾静脉方式回输给口服重组乳酸菌免疫后的小鼠,18 h后流式细胞术检测免疫后小鼠的脾细胞特异性杀伤能力。基于以上实验结果,用免疫磁珠分选口服重组乳酸菌的BALB/c小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,通过尾静脉回输NOD-SCID缺陷小鼠,12 h后感染同源禽流感病毒mH9N2,验证口服免疫后小鼠的T细胞亚群对NOD-SCID缺陷小鼠的保护作用。结果显示,重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep能显著诱导免疫后小鼠脾脏特异性CD4+和CD8+T细胞增殖能力、CD8+CD107a+的表达水平以及脾细胞杀伤能力。回输NOD-SCID缺陷小鼠发现,重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep免疫的小鼠CD4+T细胞和CD4+T细胞与CD8+T细胞联合(1:1混合)都不能为禽流感病毒感染的NOD-SCID小鼠提供保护,但是CD8+T细胞具有较好的保护作用,能有效的延长小鼠存活时间。本实验构建了基于禽流感病毒NP、M1和树突状细胞诱导肽基因的重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep。它能诱导小鼠产生特异性T细胞免疫反应和粘膜免疫反应,能对同型鼠适应性禽流感病毒和异源流感病毒产生部分保护作用。通过NOD-SCID缺陷小鼠进一步证实口服重组乳酸菌诱导CD8+T细胞在抗禽流感病毒感染中发挥重要作用。这为研究通用型口服重组乳酸菌活载体疫苗的应用研究奠定了基础。