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两栖类皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质,用来抵御有害环境因子的侵袭,是极具开发潜力的生物资源宝库。中国拥有丰富的两栖类资源,在将近300个亚种中,其中三分之二是特有种,在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。但是,由于两栖类皮肤生物活性肽在其组织中含量少,分离获得大量的天然产物又很困难,往往不能满足进一步研究的需要。利用分子生物学技术筛选活性肽就成为必然选择,丰富了两栖类活性物质资源库,并为进一步研究活性肽表达及分离纯化奠定基础。
本论文以辽宁省抚顺市新宾县地区的中国林蛙作为试验材料,从中国林蛙皮肤中得到一系列活性肽基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法初步分析活性肽基因的序列及结构,进而研究各活性肽的生物活性,为两栖动物活性肽的开发和利用奠定理论基础。
首先,根据GenBank中蛙类皮肤生物活性肽信号肽N-端保守序列,设计引物,采用RT-PCR和3’-RACE方法,从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同活性肽前体的cDNA序列,经NCBI数据库中的Blast软件,进行氨基酸序列同源性比较之后,分别命名为:prcprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。
序列分析结果表明,6条编码中国林蛙皮肤生物活性肽前体的cDNA序列全长为289-315bp,编码59-65个氨基酸。其前体由3部分结构域组成:22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体,具有肽链短,C-端酰胺化的特点;preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体,在肽链的C-端含有RANA盒结构,可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键,组成7肽环;preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽,被鉴定为新生物活性肽。
人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤生物活性肽,抗菌和抗癌活性检测结果表明:它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用,同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。其中,temporin-1CEa对金黄葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和乳链球菌抑制作用较强,同时对2种癌细胞有明显的抑制作用,而且溶血作用弱。有望成为新型抗生素和抗肿瘤药物。