研究背景：　　 甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一种苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants,ATS),属新型毒品类。近年来,METH的滥用人数不断上升,全球滥用人数仅次于大麻,成为危害最为严重和广泛的毒品之一。临床资料显示,METH可导致人体出现好动、肌肉不自主收缩、震颤、血压升高等症状,以及兴奋、焦虑、幻觉、认知功能和精神活动障碍,甚至死亡。METH具有药物依赖性、中枢神经兴奋和拟交感效应等药理、毒理学特性。研究显示,METH有较强的神经毒性,主要表现为脑组织多巴胺水平下降、多巴胺能神经轴索受损、酪氨酸羟化酶(TH)活性降低、多巴胺摄取位点(DA uptakesites)和单胺递质转运小泡(versicular monoamine transporters,VMAT-2)浓度下降、神经细胞凋亡等。经本课题组前期研究,发现了一种新型的NO生成调节酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase1,DDAH1)在纹状体和皮质内表达升高。引起了我们进一步探索的兴趣。DDAH主要参与不对称二甲精氨酸(asymmetric dimethylated L-arginine,ADMA)的分解代谢。而ADMA是内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂,对三种亚型的NOS均有抑制作用。DDAH1通过调节组织内ADMA的降解率,从而调节组织中NOS的活性和一氧化氮(nitric oxide,NO)的合成。NOS的活性和NO的合成增加可导致大量的活性氮产生,引起蛋白质的亚硝酰化、硝基化、氧化损伤等。其中关键蛋白质的硝基化可以导致相关功能的丧失。研究表明,在肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、阿茨海默病等神经退行性疾病中,多种关键蛋白质酪氨酸残疾的硝基化及硝基化水平的增加是这些疾病病理过程的重要环节。我们及其他学者的研究结果显示,动物注射METH后,脑组织中NO含量增高,nNOS活性增强,神经细胞内3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)表达增强。应用nNOS的抑制剂7-硝基吲唑可以减轻MA的神经毒性作用,而特异性的敲除nNOS基因同样表现出保护作用。提示nNOS/NO在METH的神经毒性机制中发挥重要作用,研究nNOS/NO的可能调控机制,对阐明METH神经毒性机理和寻找药物治疗靶点,均有显著意义。　　 METH对心、肝、肾等内脏器官和横纹肌有不同程度的损伤作用,已有研究表明,METH可刺激周围神经系统释放大量儿茶酚胺类物质,引起血管收缩、血管痉挛、心动过速和血压增高。Colin Davidson等认为METH长期应用引起的损伤主要是由细胞凋亡引起的细胞死亡。有关METH导致神经细胞凋亡机制的研究提示,JNK/SAPK-c-Jun通路、线粒体细胞死亡通路、内质网介导的应激通路等均可能和METH毒性相关。但目前关于机体毒性损伤及损伤机制尚未明确。目前研究METH多数以急性中毒模型为主,但目前关于人的METH的研究,及METH中毒入院多数是经诊断确定的终生METH依赖患者,因此,慢性METH中毒的研究,仍然十分重要。故本次实验以慢性METH中毒模型为基础。　　 目的：　　 建立METH慢性中毒动物模型并收集健康人和METH依赖者血清,运用病理学、行为学、神经化学等方法,全面了解METH毒性作用;在此基础上,运用比较蛋白质组学方法,筛查血清中与METH毒性作用密切相关的差异表达蛋白质,根据蛋白质的功能,探讨METH的机体毒性机制。　　 方法：　　 1.METH慢性中毒大鼠模型的建立和毒性观察Wistar大鼠40只,180-220g,随机分为实验组(A1)和对照组(A2)各20只,实验组动物腹腔注射METH,按从6mg/kg的剂量递增,到15mg/kg为最大剂量,每周用药5天,每天2次(8:00AM,7:00PM),共用药8周,制成METH慢性中毒模型。对照组注射等量生理盐水。观察动物的行为变化,体重、饮水量的变化和脑、心、肝、肺、肾等主要脏器的病理学变化。　　 2.METH致死大鼠法医病理学分析　　 Wistar大鼠10只,180-220g,腹腔注射METH,按从6mg/kg的剂量递增,每2天增加0.5mg/kg,每天2次(8:00AM,7:00PM),连续注射致大鼠死亡。观察动物死亡前症状及体征的变化,死亡后24h内解剖观察各脏器组织的形态学改变,HE染色观察脑、心、肝、肺、肾等主要脏器的病理学变化。　　 3.慢性METH中毒大鼠及人毒性相关硝基化损伤水平的检测　　 慢性METH中毒模型建模结束后用10％的水合氯醛腹腔麻醉,于门静脉采集血液标本并分离血清,分为实验组(A1)和对照组(A2)；收集经临床诊断为终身METH依赖且未治疗时血清(B1)及健康人体血清(B2)。采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清3-NT含量,判断METH中毒后机体硝基化损伤水平。　　 4.慢性METH中毒大鼠及人机体毒性机制的比较蛋白质组学研究　　 采用双相电泳技术分离A1和A2,B1和B2血清蛋白质,筛选差异表达的蛋白质点,进行串联质谱鉴定,根据蛋白质的相关功能,探讨METH的机体毒性机制。　　 结果：　　 1.METH注射后动物具有明显的食欲抑制作用,导致动物体重下降(P<0.001)；其拟交感作用导致动物饮水量增加(P<0.001)；METH导致动物出现明显的行为改变,主要表现为好动、易激惹等,动物刻板行为评分明显高于对照组(P<0.001)。脑皮质、纹状体神经细胞周围水肿、神经元变性、纹状体轴索损伤,胶质细胞增生。心肌嗜酸性变、心肌细胞变性、局灶性肌纤维断裂,肝细胞水肿,肺间质充血,炎细胞浸润。　　 2.所有大鼠死亡前1-3天内未进食及饮水、或少量饮水,体重下降明显。腹部触之较硬,大小便次数明显减少；其中六只大鼠死亡前1-4天内出现明显的肺部损伤症状及体征:咯血、持续性喘息、呼吸急促、张口呼吸、痰鸣音等。解剖见部分大鼠SAH,肺高度胀气、出血、淤血。病理学观察见脑皮质及纹状体区神经细胞周围明显水肿、神经元变性,纹状体轴索扭曲、蛇形状、有阶段性增粗和轴索间隙增宽、胶质细胞增多,蛛网膜下腔出血；心肌局灶性心肌纤维断裂、肌溶灶形成并可见部分区域心肌收缩带坏死心肌间质出血；肺间质淤血,出血,灶性炎细胞浸润,部分肺泡腔内可见炎性渗出,过度充气,小气管花边样变；肝淤血,散在肝细胞水肿、坏死。　　 3.慢性METH中毒大鼠及METH依赖者血清中3-NT含量均显著升高,差异有统计学意义(A:t=17.112,p<0.001；B:t=17.180,p<0.001)。　　 4.通过比较蛋白质组学分析,分别在大鼠血清中发现12个、人体血清中9个,这些蛋白质分别与炎性介导、免疫应答、蛋白酶体功能、神经退行性变/凋亡、细胞骨架蛋白重构、物质转运有关。大鼠和人血清差异蛋白谱的变化各不相同,但部分蛋白质在大鼠和人体血清中同时表达上调或下调。　　 结论：　　 1.METH具有明显的神经毒性作用,可造成纹状体、皮质等多脑区损伤和动物行为改变,并对心、肝、肺等器官有一定毒性作用。　　 2.METH主要通过对肺部严重损伤致脑、心、肺多器官功能急性衰竭致死。　　 3.METH慢性中毒可以导致蛋白质硝基化损伤水平升高,说明METH导致相关蛋白质硝基化损伤可能是METH机体毒性的一个重要因为。　　 4.炎性反应、免疫应答、蛋白酶体功能、神经退行性变/凋亡、细胞骨架蛋白重构、物质转运等机制参与METH机体毒性作用。