脑中风是人类首要致残因素和三大致死因素之一,其主要临床类型为大脑中动脉栓塞引起的缺血性脑中风(约占85%),其病理表现为纹状体和额顶叶皮层广泛的神经细胞死亡。欧洲的流行病学调查显示,65岁以上的中风幸存者中,约有1/3的患者在中风后3个月内发展成痴呆,此外,在老年性痴呆(Alzheimer’s disease, AD)患者尸体解剖表明约30%的AD脑内有过中风的病理改变。痴呆在很大程度上是由于神经退行性变导致,而缺血性神经元死亡与神经退行性变之间存在着复杂而又紧密联系的通路,caspase-3依赖的凋亡通路是其中研究较多的机制之一。在我们以往的动物实验研究中发现,脑缺血数周后学习和记忆功能明显降低,其海马区域的神经元能够被退行性变的标记物及caspase-3所标记。此外,AD的一个主要病理改变是脑内老年斑的形成,而老年斑是由β淀粉样蛋白(Aβ)沉积所致。Aβ通过其前体蛋白APP经β-分泌酶和γ-分泌酶剪切生成,BACE1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme,BACE1)是Aβ产生的限速酶。BACE1的代谢途径有多种,其中泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是其一主要通路。已有文献报道,在AD及中风病人脑内存在UPS功能异常,脑缺血能够引起脑内蛋白酶体活性下降,正常泛素缺失及突变泛素UBB+1的增多。UBB+1是在UBB(ubiquitin B)的两个重复序列中发生双核苷酸缺失而发生分子错读后形成的异常蛋白,UBB+1蛋白缺少正常泛素C末端的氨基乙酸,并比正常泛素多出19个氨基酸。在生理状态下,UBB+1呈低水平表达,可以被泛素化,靶向蛋白酶体并被其降解；然而在病理状态下,高表达水平的UBB+1能够竞争性抑制蛋白酶体的活性导致UPS功能异常,因此,过量堆积的UBB+1被认为是反映蛋白酶体功能异常的内源性标记物。在短暂性全脑缺血模型研究中,UBB+11能够聚积在海马的锥体神经元,而这些神经元在早期表达caspase-3并在后期走向凋亡,提示UBB+1与caspase-3之间存在着某种联系。我们实验室的前期结果表明,缺血诱导激活的caspase-3通过增加BACE1的蛋白量和蛋白活性增加脑内Aβ的生成,并且缺血能够引起脑内UBB+1的增多。因此,我们提出假设：缺血损伤脑内caspase-3激活参与脑内UBB+1的生成并调节UBB+1与BACE1的结合水平,从而导致Aβ及oligomer的聚积。由于临床上中风病人多为老年人,因此在老年动物缺血模型上研究痴呆相关病理变化的形成机制显得尤为重要,本论文将研究在老年动物缺血损伤脑内痴呆相关病理变化的形成并探讨其机制。为了进行上述研究,本文采用大鼠短暂性脑缺血模型,首先在不同年龄大鼠缺血后纹状体部位观察UBB+1、Aβ、BACE1活性、活化caspase-3及oligomer等表达变化；其次,结合免疫组化、免疫荧光、免疫印迹和免疫沉淀等方法,探讨了脑缺血损伤后纹状体内突变泛素UBB+1,Aβ,BACE1,活化caspase-3, oligomer的细胞分布特征和共分布情况；并通过侧脑室注射caspase-3抑制剂,观察抑制caspase-3活性对oligomer单标细胞数及UBB+1与BACE1/Aβ/oligomer共标细胞数的影响,并检测抑制caspase-3活性后UBB+1蛋白、BACE1蛋白含量的变化及UBB+1-BACE1复合物的表达变化。研究结果如下：1.缺血损伤脑内UBB+1,Aβ,BACE1活性,活化caspase-3,oligomer时程及年龄依赖地表达增加6、12、18月龄大鼠分别给予大脑中动脉缺血30分钟,在再灌1天,7天,14天后观测纹状体部位UBB+1,Aβ,BACE1活性,活化caspase-3及oligomer的表达变化。从免疫组化的实物图可以看出,在缺血再灌1天,6、12、18月龄大鼠同侧纹状体部位的UBB+1、Aβ及oligomer未见明显增多,而活化caspase-3已有表达增多；在缺血再灌7天,14天,UBB+1、Aβ、活化caspase-3及oligomer均出现明显增多。UBB+1、Aβ免疫阳性细胞多表现为激活的星型胶质细胞形态,活化caspase-3染色较深且胞核较大,而oligomer的细胞分布具有多样性,有的分布在胞体,有的分布在细胞突起,有的分布在细胞外间隙。从细胞计数的统计图可以看出,6、12、18月龄大鼠在缺血后7天,14天,同侧纹状体部位UBB+1、Aβ阳性细胞显著增多,与对照组相比有统计学差异；活化caspase-3在缺血再灌1天、7天、14天同侧纹状体均表达增多；此外,缺血再灌7天,18月龄大鼠的UBB+1、Aβ、活化caspase-3与6、12月龄大鼠相比无显著差异,而在缺血后14天,18月龄大鼠的UBB+1、Aβ、活化caspase-3比6、12月龄大鼠表达增多；通过免疫印迹等方法学,我们发现18月龄大鼠缺血再灌7天、14天其纹状体内BACE1活性较6月龄、12月龄大鼠显著增高。2.缺血损伤脑内纹状体部位UBB+1的细胞定位及与BACE1,Aβ,oligomer的分布关系我们采用免疫荧光多标技术结合共聚焦荧光显微镜的方法对大鼠缺血后纹状体内UBB+1及BACE1,Aβ及oligomer进行细胞定位及其分布关系分析。结果显示：大鼠脑缺血后,缺血侧纹状体内大量UBB+1阳性细胞主要存在于激活的星型胶质细胞。此外,UBB+1与BACE1,Aβ及oligomer在缺血侧纹状体具有共标现象,UBB+1-BACE1,UBB+1-Aβ双标细胞及UBB+1-Aβ-oligomer三标细胞在缺血侧纹状体的细胞密度显著高于缺血对侧纹状体；并且在缺血再灌14天,18月龄大鼠缺血侧纹状体的UBB+1-Aβ-oligomer三标细胞比6月龄大鼠表达增多。3.缺血损伤脑内纹状体部位UBB+1与BACE1,Aβ,oligomer分布关系的机制分析3.1缺血损伤对大鼠脑内UBB+1、BACE1蛋白及其复合物的影响3月龄大鼠大脑中动脉缺血30分钟,再灌后7天处死动物,western blot检测发现,UBB+1及BACE1蛋白水平在缺血侧纹状体较对侧纹状体明显增高。此外,通过免疫沉淀等方法检测发现,UBB+1蛋白与BACE1蛋白能够相互结合形成复合物。并且UBB+1-BACE1复合物在缺血侧纹状体较缺血对侧纹状体显著增加。3.2缺血损伤脑内活化caspase-3与UBB+1及BACE1、Aβ、oligomer的关系研究3.2.1大鼠缺血损伤纹状体内UBB+1及活化caspase-3的时程表达变化3月龄大鼠大脑中动脉缺血30分钟,再灌后1天,3天,7天,14天处死动物,灌注取脑切片,脑片做UBB+1及活化caspase-3免疫组化实验。结果显示,未缺血的对照大鼠其纹状体部位的UBB+1阳性细胞很少,免疫阳性细胞主要是神经元样细胞；缺血后1天,纹状体部位UBB+1阳性细胞与对照组相比未见明显增多；缺血后7天,同侧纹状体部位UBB+1阳性细胞比对照组明显增多,UBB+1免疫阳性细胞主要是激活样的星型胶质细胞,这些UBB+1阳性细胞多分布于侧脑室边上和缺血梗塞灶周边区。细胞计数的统计图结果显示,缺血同侧纹状体部位的UBB+1阳性细胞在缺血后1天未见增多,在缺血后3天增多,7天时达到高峰,14天时略有下降但仍高于对照组。活化caspase-3免疫组化实物放大图显示,未缺血的对照大鼠其纹状体部位的活化caspase-3染色较浅,胞核较小；缺血后1天,纹状体部位活化caspase-3阳性细胞与对照组相比即有明显增多；缺血后7天,活化caspase-3阳性细胞进一步增多,激活的caspase-3染色较深且胞核较大。细胞计数结果表明,与正常组相比,缺血侧活化caspase-3的免疫阳性细胞在缺血再灌1天时就显著性增加,3天继续少量增加,7天时达到高峰,14天略有下降。3.2.2大鼠缺血损伤纹状体内活化caspase-3与UBB+1及BACE1、Aβ、oligomer的细胞共定位研究发现,缺血损伤侧纹状体大多数UBB+1阳性信号与活化caspase-3信号共标于同一细胞,缺血侧纹状体UBB+1与活化caspase-3双标细胞数较缺血对侧纹状体显著增多。此外在缺血侧纹状体内,活化caspase-3与UBB+1及BACE1、Aβ、oligomer具有细胞共定位现象,并且缺血侧纹状体UBB+1,BACE1/Aβ及活化caspase-3三标细胞数较缺血对侧纹状体明显增多。3.3抑制caspase-3活性对大鼠缺血损伤脑内oligomer单标细胞数及UBB+1与BACE1/Aβ/oligomer共标细胞数的影响我们在大鼠侧脑室注射caspase-3的选择性抑制剂DEVD,通过免疫组化、免疫荧光共聚焦及细胞计数等方法来检测抑制caspase-3活性对缺血损伤脑内oligomer单标细胞数及UBB+1与BACEl/Aβ/oligomer共标细胞数的影响。研究发现,在缺血侧纹状体,oligomer单标细胞数及UBB+1与BACE1/Aβ/oligomer共标细胞数显著增多,而给予caspase-3抑制剂DEVD后,此单标及共标细胞数均显著减少。3.4抑制caspase-3活性对大鼠缺血损伤脑内诱导增加的UBB+1蛋白,BACE1蛋白以及UBB+1-BACE1复合物蛋白的影响为了验证缺血损伤脑内caspase-3的激活是否参与调节UBB+1蛋白,BACE1蛋白以及UBB+1-BACE1复合物蛋白的生成,我们通过免疫印迹、免疫沉淀等方法观测caspase-3活性抑制对缺血诱导增加的UBB+1蛋白,BACE1蛋白以及UBB+1-BACE1复合物蛋白的影响。结果显示,DEVD显著减少缺血诱导增加的UBB+1蛋白及BACE1蛋白。此外,免疫沉淀结果显示,UBB+1蛋白与BACE1蛋白相互结合形成复合物,并且UBB+1-BACE1复合物在缺血侧纹状体显著增加,而caspase-3抑制剂DEVD能够显著减少缺血诱导增加的UBB+1-BACE1复合物。小结：1.缺血损伤脑内UBB+1,Aβ,BACE1活性,活化caspase-3,oligomer时程及年龄依赖地表达增加；2.缺血损伤脑内UBB+1与活化caspase-3,BACE1,Aβ及oligomer共标；UBB+1与BACE1结合形成复合物；3.抑制caspase-3活性减少缺血诱导增加的oligomer单标细胞数及UBB+1与BACE1/Aβ/oligomer共标细胞数,并减少缺血诱导增加的UBB+1蛋白,BACE1蛋白及UBB+1-BACE1复合物蛋白。结论及意义：脑中风损伤脑内caspase-3激活诱导UBB+1蛋白生成增加,从而增加UBB+1与BACE1蛋白的结合形式,增加脑内BACE1蛋白的活性,导致Aβ及oligomer在脑内的聚积。本研究揭示了缺血损伤脑内caspase调节UPS功能的新的生物学效应,并为预防脑中风病人的神经退行性变提供了新的治疗靶点。