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假俭草[Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack]是一种重要的暖季型草坪草,它具有植株低矮、分蘖能力强、茎叶密集、耐贫瘠、生长缓慢、耐粗放管理、再生能力强、病虫害少等优点,是建植各类草坪及高等级公路边坡护坡、堤坝护埂、治理水土流失的理想材料,尤其是近年来在高尔夫发球台和球道也得到应用.假俭草建成的草坪以低养护管理水平即能获得较高的草坪质量,但它存在耐寒性差、抗旱能力不强等需待改良的缺点,并且可供实际应用的品种不多.一直以来,假俭草的育种进程非常缓慢,尤其是在抗逆性育种方面成果很少.由于该草种结实率很低,制约了杂交育种等传统手段的应用,因而在该草种的改良上引入细胞工程和基因工程等现代生物技术手段显得非常必要.假俭草生物技术育种的研究目前无文献报道.本文对其再生体系、体细胞无性系变异和农杆菌转化体系进行了研究,主要取得了以下实验结果:
1、建立了假俭草高效持久的再生体系
以假俭草的成熟种子为外植体,系统研究了外植体消毒、愈伤诱导、继代、分化、生根等步骤,得到了下列优化方案: 种子消毒方式:浓硫酸处理30秒,3.5％次氯酸钠消毒20分钟诱导培养基:MS+2.4-D4.5mg/L+6-BA0.1mg/L. 继代培养基:MS+2.4-D4mg/L＋6-BA0.1mg/L分化培养基:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0 mg/L生根培养基:1/2MS采用上述方案,建立了胚性愈伤至今已维持两年多的再生系统.此外,通过石蜡切片、扫描电镜和光学显微镜解剖观察,发现体细胞胚胎发生是假俭草离体再生的主要方式.
2、获得了假俭草体细胞无性系变异植株
通过长期继代和长期间断低温处理两种策略诱发假俭草体细胞无性系变异,长达两年继代的胚性愈伤通过再生获得500个植株组成的群体(群体A)；长期间断低温处理的胚性愈伤通过再生获得300个植株组成的群体(群体B).
在群体A和群体B两个群体中,发现了外观形态发生改变的变异植株,2个叶长变短,叶宽变窄以及顶端第四片叶以下的三节长显著变短的矮化植株,6个在假俭草自然花期期间未见生殖生长的变异植株.此外,在转基因PCR阴性植株中发现1个花叶植株. 通过对群体A的干旱筛选,得到5个抗旱性比对照提高的变异植株,编号为EOD1-EOD5,干旱处理前各植株的相对含水量、相对电导率、SOD活性、CAT活性、MDA含量及脯氨酸差异不显著,干旱处理结束时的测定表明:变异植株叶片的相对含水量高于对照,而相对电导率则低于对照,所有植株的相对电导率均变大,但抗旱植株的增幅小于对照；变异植株的SOD活性、CAT活性均高于对照；各植株的MDA含量均比干旱前大,但抗旱植株的增幅小于对照,所有抗旱植株的MDA比对照低.干旱结束时所有植株的脯氨酸均大幅升高,但抗旱植株的脯氨酸含量并不比对照高.本文认为更高的抗氧化系统活力是变异植株抗旱性提高的原因.
通过对群体B的低温筛选,获得5个耐寒性比对照提高的变异植株,编号为EOC1-EOC5,生理测定表明:干旱处理前各植株的最大光化学效率(Fv/Fm)、相对电导率、SOD活性、CAT活性、MDA含量差异不显著.低温处理之后所有植株的Fv/Fm均下降,但耐寒植株EOC1-EOC5的Fv/Fm比对照的高.对照的Fv/Fm降低幅度超过40％,耐寒植株的降低幅度在4％-8％之间,对照的降低幅度远大于耐寒植株；低温处理完后所有植株的相对电导率均变大,但对照的相对电导率的增幅最大,达7.06倍,而耐寒植株EOC5和EOC1的增幅分别为2.21、2.66倍,显著小于对照的增幅.MDA的变化趋势与相对电导率相似,即所有植株的MDA含量均变大,但耐寒植株的增加幅度小于对照,所有耐寒植株的MDA含量低于对照.SOD和CAT的活性低温处理后均升高,升高的幅度大于对照,所有耐寒植株的SOD和CAT的活性高于对照.本文认为更高的抗氧化系统活力是变异植株耐寒性性提高的原因.
RAPD分析表明,相同的引物在对照和变异植株间可以重复扩增出不同的条带,虽然这些引物检测到的差异不一定就是变异体抗性提高的分子证据,但说明了变异植株跟亲本间存在DNA水平上的差异.
3、建立了假俭草农杆菌转化体系
以pCAMBIA1301为转化载体,采用EHA105农杆菌菌株,通过GUS瞬时表达得到下列优化的主要农杆菌转化参数:
合适菌液浸染浓度:OD600:0.3合适共培养温度:27℃
合适浸染方法:负压处理处理4min,静置11min合适培养时间:3天采用上述转化参数,使得胚性愈伤共培养完后的GUS瞬时表达率达到40％.
通过抗生素敏感性实验,确定了抗性愈伤筛选的潮霉素临界浓度为100 mg/L；分化筛选的潮霉素临界浓度为50 mg/L；生根筛选的潮霉素临界浓度为30 mg/L,并确定了抑制农杆菌的合适抗生素组合为:Carb 200 mg/L+Cefo 200 mg/L.
采用上述转化参数和筛选参数,得到了PCR检测阳性植株、对部分PCR阳性植株进一步进行Southern杂交,其中2株有潮霉素杂交信号,说明T—DNA区域已整合到假俭草基因组上.同时,潮霉素离体抗性及植株叶片和根的GUS染色结果表明,编号2、3、4、6具有潮霉素抗性,编号2具有潮霉素抗性和GUS活性,说明hpt基因和gus基因得到了表达.