目的:建立可靠稳定的明暗箱图像分析处理系统以及焦虑动物模型,提供客观规范的抗焦虑中药药效评价方法;在此基础上研究荷叶黄酮的抗焦虑作用,为抗焦虑中药提供候选药物。方法:1明暗箱图像分析处理系统的建立1.1明暗箱图像分析处理系统的研制系统采用摄像视频跟踪技术识别目标。硬件系统采用封闭的箱体,红外灯作为背景光源,白炽灯作为明室光源,模拟自然环境。软件采用Microsoft Visua1 C++6.0开发,利用图像处理、数据挖掘等技术提取多项指标体系以及图像信息。1.2系统可靠性、稳定性的验证(1)40只Wistar大鼠,随机分为两组:明室无灯组(明室灯光照度为2 lux,暗室照度为2 lux)、明室有灯组(明室灯光照度为400 lux,暗室照度为2 lux),录制视频,人工记录5min内Wistar大鼠在检测箱中两室滞留时间,对系统所提供的明暗环境的进行验证。(2)明暗环境成立的基础上,人工手动记录5min内40只Wistar大鼠在检测箱中的运动时间,同时软件根据不同的运动阈值(运动阈值取9、18、27、36、45、54 cm/s),分析得到不同的运动时间。将两者记录得到的运动时间进行相关性分析,确定最佳的运动阈值。(3)在成立的明暗环境和最佳运动阈值下,记录5 min内20只Wistar大鼠的穿箱次数、入暗次数、明室时间以及暗室时间等指标,并将人工记录数据与软件分析结果进行相关性分析,对指标可靠性进行验证。2焦虑动物模型的建立2.1慢性应激致雌雄大鼠焦虑模型的建立雌雄各24只SD大鼠,随机分为雌性正常组、雄性正常组、雌性模型组、雌性模型组。慢性应激模型组采用足电、禁水、禁食、光照、黑暗、单笼、倾斜等9种应激因子刺激21天,每天随机进行1种应激刺激。造模结束后,进行大鼠旷场实验、新奇事物探索实验、明暗箱实验。2.2不确定性空瓶饮水应激致大鼠焦虑模型的建立16只SD大鼠随机分为:正常组、空瓶应激模型组。分别在造模第7 d、14 d、21 d采用旷场实验、新奇事物探索实验和明暗箱实验评价不确定性空瓶应激对SD大鼠焦虑的影响。2.3慢性束缚致小鼠焦虑模型的建立30只ICR小鼠按体重随机分为:正常对照组、慢性束缚模型组。模型组每天束缚1次,每次6 h。14天后采用采用旷场实验、明暗箱实验、高架十字迷宫实验评价CRS对小鼠自主活动能力以及焦虑的影响。3荷叶黄酮抗焦虑作用研究3.1荷叶黄酮对状态性焦虑模型的抗焦虑作用研究90只ICR小鼠随机分为空白对照组(0.5%CMC-Na)、荷叶黄酮低、中、高剂量组(0.75、1.5、3 g/kg)、阳性药1组(氢溴酸西酞普兰10mg/kg)、阳性药2组(地西泮2 mg/kg)。灌胃给药14天后,采用旷场实验、高架十字迷宫实验、明暗箱实验评价荷叶黄酮对小鼠自主活动能力及焦虑的影响。’3.2荷叶黄酮对小鼠慢性束缚状态性焦虑模型的抗焦虑作用研究105只ICR小鼠随机分正常对照组、束缚6h模型组、荷叶黄酮低、中、高剂量组(0.75、1.5、3 g/kg)、阳性药1组(氢溴酸西酞普兰10mg/kg)、阳性药2组(地西泮2 mg/kg),灌胃给药14天后,采用旷场实验、明暗箱实验、高架十字迷宫实验评价荷叶黄酮对CRS模型小鼠自主活动能力以及焦虑的影响。结果:1明暗箱图像分析处理系统的建立1.1明暗箱图像分析处理系统的研制建立了稳定可靠、单次可检测4样本、提取明室时间、穿箱次数、运动时间等20多项指标体系以及多种图像信息的明暗箱实验图像分析处理系统。1.2系统可靠性、稳定性的验证:(1)明室有灯组的穿箱次数(P<0.05)、明室时间(P<0.01)显著减少、暗室时间显著增加(P<0.05),且暗室时间所占百分率为79.4%。(2)当运动阈值为18 cm/s时,r为0.996,人机相关系数最高(P<0.01)。(3)运动阈值为18 cm/s时,穿箱次数、明室滞留时间、暗室滞留时间等指标参数的人机相关性系数r均大于0.99(P<0.01)。2焦虑动物模型的建立2.1慢性应激致雌雄大鼠焦虑模型的建立雌雄模型组的中央运动时间、中央区运动时间比率、明室时间、穿箱次数均显著减少(P<0.01或p<0.05),探索潜伏期(P<0.01)均显著性增加。2.2不确定性空瓶饮水应激致大鼠焦虑模型的建立不确定空瓶模型在14d、21d时,分别与对应空白组相比,中央运动时间、明室时间显著减少(P<0.05)、探索潜伏期显著增加(P<0.05或P<0.01)。2.3慢性束缚致小鼠焦虑模型的建立束缚模型组的中央区时间、中央区时间比率、穿箱次数、开臂时间、开臂时间百分比、开臂次数百分比均显著减少(P<0.05或P<0.01)。3荷叶黄酮抗焦虑作用研究3.1荷叶黄酮对状态性焦虑模型的抗焦虑作用研究荷叶黄酮(3g/kg)可显著增加ICR小鼠OE(P<0.01)。3.2荷叶黄酮对小鼠慢性束缚状态性焦虑模型的抗焦虑作用研究与空白组相比,CRS模型组的OE%、0T%、明室时间、穿箱次数的均显著减少(P<0.05)。与CRS模型组相比,荷叶黄酮(3g/kg)组的OE、OE%、OT%、穿箱次数显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论:本研究采用视频跟踪、图像处理、数据挖掘等技术,创新性的研制了提取信息量大、数据可靠、单次检测样本量大、自动化程度高的明暗箱图像分析处理系统;从心理应激、躯体应激、社会应激等诱发因素角度,成功建立了慢性应激(9种应激)、不确定性空瓶饮水应激(14d,21d)、慢性束缚(6h/d,14d)三种稳定可靠、重复性较好的焦虑动物模型。基于此,研究荷叶的抗焦虑作用,得出荷叶黄酮(3g/kg)对状态性、特质性焦虑模型有抗焦虑作用。