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本研究利用定点突变和随机突变的技术手段。对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)进行了最适作用温度、高温稳定性及低温适应性的蛋白质工程改造,结果如下: 1、PEL基因的定点突变 采用重叠延伸PCR的方法对PEL基因进行了E83V、T88P、K226R、E54P的定点突变,利用大引物PCR的方法进行了E214P的突变。突变基因在毕赤酵母GS115中表达,对突变体的最适作用温度和热稳定性的研究结果表明:突变体PEL-E83V-GS的最适作用温度提高了5.0℃,其比活约为野生型的2倍,热稳定性略有下降。说明了突变后疏水性较强的氨基酸Val可能增加了酶分子的表面疏水性,从而提高酶分子的疏水性包装效率;突变体PEL-E214P-GS的最适作用温度比野生型提高了7.5℃,热稳定性也提高了2.4℃,体现了Pro对热稳定性的特殊贡献:突变体PEL-T88P-GS的最适作用温度比野生型提高了2.5℃,但热稳定性无明显变化,而点E54P突变后则完全失去酶活:突变体PEL-K226R-GS的最适作用温度比野生型提高了5.0℃,但热稳定性和酶活有所下降。说明了Arg替换Lys后,脂肪酶与底物可能形成了额外的氢键,但同时也可能形成了空间位阻。 2、PEL基因的随机突变 用易错PCR的定向进化技术手段对PEL基因进行了随机突变,PCR产物与载体pPIC3.5K构建重组表达质粒,转化大肠杆菌构建突变文库。突变文库的混合质粒电转化毕赤酵母,通过对7000个重组菌的筛选,第一轮筛选出60个克隆子。然后进行第二轮摇瓶发酵复筛,得到一株低温适应性的突变体ep33,其最适作用温度为30.0℃,下降了10.0℃,其热稳定性也表现出低温酶的特性。核苷酸序列分析结果表明:601位的C突变为G,603位的C突变为G,即PEL基因163位的Pro(CCC)突变为Ala(GCG)。