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血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment,VCI）是一种病因复杂的临床综合征。近年来,随着人口老龄化程度加重以及脑血管疾病高发,VCI的发病率也日益增加,已成为仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆类型。目前关于VCI发病机制的假说较多,包括神经血管单元失调、血脑屏障受损、线粒体功能受损、小胶质细胞过度激活、神经炎症以及氧化应激损伤等。铁死亡概念自2012年被提出以来,已被证实参与了多种神经系统疾病的病理过程,包括脑出血、蛛网膜下腔出血、脑缺血/再灌注损伤等脑血管疾病,这也间接提示了铁死亡可能参与了VCI的病理损伤,目前关于铁死亡是否直接介导参与VCI发生发展的研究相对较少。本研究通过双侧颈总动脉永久性结扎（Permanent bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO or two vessel occlusion,2VO）构建慢性脑缺血（Chronic Cerebral Hypoperfusion,CCH）大鼠模型,模拟VCI病理事件,探究铁死亡是否参与了CCH致认知障碍。已知反应活性氧（reactive oxygen species,ROS）不可控性地增加是铁死亡的终末核心事件,机体内的ROS有很大一部分来源于线粒体,因此靶向清除线粒体来源的ROS显得尤为重要。米托蒽醌甲磺酸盐（mitoquinone mesylate,mitoQ）就是基于此研发的药物,它是目前应用较广泛的线粒体靶向的抗氧化剂。目前关于mitoQ治疗慢性脑缺血的相关研究较少,本研究选择mitoQ作为治疗药物,干预慢性脑缺血中铁死亡相关的氧化应激损伤,并进一步探讨其发挥神经保护作用的分子靶点及通路,以期望为VCI的治疗开辟新的思路及研究方向。第一部分:铁死亡参与慢性脑缺血病理损伤目的:通过2VO构建CCH大鼠模型,探讨铁死亡是否参与了慢性脑缺血病理损伤。方法:选择体重250～300g,8～10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,2VO方法构建CCH大鼠模型,实验分为3组:control、sham、2VO组,术后6周进行Morris水迷宫实验,行为学实验结束后经心灌流,分离提取海马组织,石蜡切片进行HE、尼氏染色观察海马组织CA1、CA3区神经元结构改变;试剂盒检测海马组织总铁、SOD、MDA、GSH含量;western blot检测海马组织GPX4、COX2等蛋白水平;冰冻切片ROS荧光染色观察海马组织CA1、CA3区ROS含量;线粒体分离试剂盒提取新鲜海马组织线粒体,线粒体膜电位JC-1试剂盒检测线粒体膜电位;透射电镜观察线粒体超微结构变化。结果:（1）2VO构建CCH大鼠模型,手术成功率为87%,术后6周进行Morris水迷宫实验,2VO组大鼠出现明显的认知功能障碍。（2）2VO组大鼠海马细胞带神经元结构损伤明显,以CA1区为著。（3）2VO组大鼠发生了铁死亡事件:与control、sham组相比,海马组织总铁含量显著增加（P＜0.01）（铁超载）;海马组织ROS含量、MDA含量、COX2蛋白水平显著增高（P＜0.01）,SOD含量显著减低（P＜0.001）（氧化应激损伤）;GPX4蛋白水平、GSH含量显著降低（P＜0.05）（GPX4/GSH轴失调）。（4）2VO组大鼠线粒体结构、功能受损,表现为:线粒体体积变小、变致密,基质局部空化,嵴扩张甚至消失,有的线粒体内外膜结构消失;与control、sham组比较,2VO组线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）。结论:（1）CCH导致大鼠认知功能障碍。（2）铁死亡参与介导了CCH病理损伤。第二部分:mitoQ通过调控Nrf2/AREs/GPX4通路抑制铁死亡介导的慢性脑缺血致认知障碍目的:探讨mitoQ对CCH大鼠的保护作用,明确其是否可以改善CCH大鼠的认知功能障碍;是否可以减轻CCH大鼠体内铁死亡相关的氧化应激损伤;是否可以保护线粒体结构、功能的完整性;进一步探究其是否通过调控Nrf2/AREs/GPX4通路发挥神经保护作用。方法:（1）体内实验:2VO方法构建CCH大鼠模型,实验分为3大组:sham+0.9%Na Cl、2VO+0.9%Na Cl、2VO+mitoQ组,mitoQ设置3个剂量亚组:2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg。术后第1天开始予以2VO大鼠mitoQ治疗,腹腔注射方式给药,隔天1次,共6周。术后6周进行新事物识别、Morris水迷宫实验,行为学实验结束后麻醉状态下经心灌流取材,分离提取海马组织;石蜡切片进行HE、尼氏染色观察海马组织CA1、CA3区神经元结构改变;试剂盒检测海马组织SOD、MDA、GSH含量;细胞核与细胞浆蛋白分离试剂盒抽提胞核与胞浆部分,western blot检测胞核部分的Nrf2蛋白,胞浆部分的Nrf2、Keap1、HO-1蛋白;western blot检测海马组织Nrf2、GPX4、Keap1、HO-1、NQO1、COX2等蛋白水平;石蜡切片进行免疫组织化学染色观察海马组织Nrf2、GPX4阳性细胞数;冰冻切片ROS荧光染色观察海马组织CA1、CA3区ROS含量;线粒体分离试剂盒提取新鲜海马组织线粒体,线粒体膜电位JC-1试剂盒检测线粒体膜电位;透射电镜观察线粒体超微结构变化。（2）体外实验:由于检测新鲜动物组织的线粒体ROS及超氧化物含量很难实现,因此本研究通过Co Cl2·6H2O+低糖无血清DMEM/F12培养基诱导SH-SY5Y细胞缺血缺氧,线粒体超氧化物红色荧光探针检测缺血缺氧细胞模型中线粒体超氧化物含量,观察mitoQ是否可以靶向线粒体,减少毒性氧化产物的产生从而发挥神经保护作用。结果:（1）探索mitoQ治疗剂量及药物不良反应:4mg/kg剂量组在实验过程中体重始终低于sham+0.9%Na Cl组、2VO+0.9%Na Cl组和mitoQ+2mg/kg组,有的出现腹泻、鼻出血,取材时大部分存在肠管肿胀;6mg/kg剂量组在给予第1针mitoQ后,陆续出现死亡,而2mg/kg剂量较安全,未见明显不良反应,因此最终选择2mg/kg的剂量,表示为mitoQ组。（2）术后6周进行新事物识别实验、Morris水迷宫实验,结果提示:mitoQ治疗可以显著改善2VO处理大鼠的认知功能障碍。（3）石蜡切片HE、尼氏染色:mitoQ组海马细胞带神经元的退行性损伤得到显著改善。（4）mitoQ改善氧化应激损伤:与2VO组相比,mitoQ组海马组织的ROS含量、MDA含量、COX2蛋白水平显著降低（P＜0.05）。（5）mitoQ促进Nrf2核转位:与2VO组相比,mitoQ组胞核部分的Nrf2蛋白水平增高,胞浆部分的Nrf2、Keap1蛋白水平显著降低（P＜0.01）,提示mitoQ促使Nrf2核转位。（6）mitoQ激活Nrf2/AREs/GPX4通路:mitoQ组的GPX4、Nrf2蛋白水平显著高于2VO组（P＜0.01）。（7）mitoQ保护线粒体结构、功能完整性:mitoQ治疗后可明显改善2VO处理后线粒体结构和功能的损伤。（8）mitoQ减少线粒体超氧化物的产生（体外实验）:Co Cl2·6H2O模型组线粒体超氧化物产生明显增加,倒置荧光显微镜下观察发现红色荧光显著多于control组,给予mitoQ治疗可以减少线粒体超氧化物的产生。结论:（1）mitoQ改善CCH大鼠的认知功能障碍。（2）mitoQ减轻CCH大鼠体内的氧化应激损伤,保护线粒体结构和功能的完整性。（3）mitoQ促进Nrf2核转位,通过激活Nrf2/AREs/GPX4通路减轻CCH大鼠体内铁死亡相关的氧化应激损伤。