课题背景肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,也是癌症相关性死亡的主要原因之一。肝细胞肝癌的早期检测困难,80%的患者初次就诊时已经处于癌症的进展期,此时缺乏有效的治疗手段去保证患者的长期生存。目前临床上常用的早期检测指标是甲胎蛋白和B超,但其敏感性不足导致检出率相对有限。因此需要发掘新的生物标志物来提高肝细胞肝癌的诊断,改善患者的治疗和预后。环状RNA是一类特殊的非编码RNA分子,是近几年来RNA领域的研究热点。环状RNA在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。文献报道指出环状RNA可在癌症组织中特异性表达,并且环状RNA可以调控肿瘤的细胞周期、凋亡、侵袭转移、自噬等疾病发展过程。因此环状RNA有潜力成为肿瘤诊断的分子标志物或治疗靶点,深入探索环状RNA与肝细胞肝癌的发生发展关系,对于提高肝细胞肝癌的诊断和预后具有十分重要的意义。基于上述原因我们设计了本课题,主要探讨了环状RNA(circBACH1)在肝细胞肝癌发生发展中的功能及其分子作用机制。从以下三个部分进行了论证:(1)检测circBACH1在肝细胞肝癌中的表达情况,并分析了 circBACH1的表达量与患者临床特征(性别、年龄、AFP、HBsAg、肿瘤体积、数量、MVI、Child-Pugh分级、分化程度、TNM分期和生存时间)之间的关系。(2)通过细胞和动物实验验证circBACH1对肝细胞肝癌细胞周期及增殖活性的影响。(3)深入探讨了 circBACH1调控肝细胞肝癌细胞周期及增殖活性的分子机制。第一部分:circBACH1表达与肝细胞肝癌临床病理特征的相关性研究目的检测circBACH1在肝细胞肝癌细胞及组织中表达情况,并分析circBACH1与患者性别、年龄、AFP、HBsAg、肿瘤体积、数量、MVI、Child-Pugh分级、分化程度、TNM分期和生存时间等临床特征之间的相关性。方法1.首先验证circBACH1的闭合环状结构。我们分别提取两组肝细胞肝癌细胞系(HepG2和Hep3B)的总RNA和基因组DNA(gDNA)。对得到的总RNA进行逆转录生成cDNA,然后通过聚合酶链式扩增反应(PCR)生成目的片段,通过Sanger测序检测产物序列是否跨过circBACH1的反向剪接位点。此外通过琼脂糖凝胶电泳实验进行进一步验证,分别设计GAPDH和circBACH1发散引物和收敛引物,以cDNA和gDNA为模板分别用这两对引物进行PCR,得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。2.选用人正常肝细胞系(L-02)和人肝细胞肝癌细胞系(HepG2,Huh7,Hep3B和SNU475)进行细胞培养。收集临床上病理证实的肝细胞肝癌组织,并对患者的临床资料(性别、年龄、AFP、HBsAg、肿瘤体积、数量、MVI、Child-Pugh分级、分化程度、TNM分期和生存时间)进行统计。通过qRT-PCR技术检测细胞和组织中circBACH1的表达情况,通过卡方检验、生存分析等统计方法,分析circBACH1与肝细胞肝癌临床表现之间的关系。结果1.Sanger测序结果显示RT-PCR的产物序列中包含circBACH1的反向剪接位点。琼脂糖凝胶电泳的实验结果显示用cDNA做模板时circBACH1的两对引物均有扩增产物,而GAPDH只有收敛引物得到扩增产物;用gDNA做模板时circBACH1和GAPDH均只有收敛引物能够得到产物。2.circBACH1在肝细胞肝癌细胞系的表达量是正常肝细胞系的2-6倍,在癌组织中表达量是癌旁的2倍左右,且差异具有统计学意义。临床资料的统计分析结果显示circBACH1的表达量与肝细胞肝癌患者的肿瘤体积(p=0.0164)和肿瘤分化程度(p=0.0019)存在统计学意义,ROC分析结果AUC=0.8506,生存分析结果(p=0.0283)。结论1.circBACH1是一个闭合环状结构的RNA分子,通过RT-PCR可以得到circBACH1的环状序列。2.circBACH1在肝细胞肝癌细胞系和癌组织中高表达,circBACH1的表达量与肝细胞肝癌的体积,分化程度和生存期之间存在相关性。3.circBACH1有潜力成为肝细胞肝癌的诊断和预后指标。第二部分:circBACH1调控肝细胞肝癌的细胞周期及增殖目的通过细胞和动物实验明确circBACH1对肝细胞肝癌细胞周期及增殖能力的调控功能方法1.用慢病毒构建稳定高表达和低表达circBACH1的HepG2和Hep3B细胞株。然后通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验,克隆形成实验,Ethynyldeoxyuridine(EdU)实验和流式细胞周期实验,检测敲除和过表达circBACH1后肝细胞肝癌的细胞增殖能力和细胞周期的变化情况。2.选用HepG2细胞系构建裸鼠皮下种植瘤模型,分五组(空白对照组,高表达circBACH1组及其对照组,低表达circBACH1组及其对照组)进行实验。定期测量并记录种植瘤体积变化情况并绘制生长曲线。4周后取下移植瘤称重,利用免疫组化技术检测(Immunohistochemistry,IHC)检测Ki-67和p27的表达情况。结果1.细胞表型实验结果显示沉默circBACH1时肝细胞癌细胞吸光度降低,克隆能力减弱,EdU阳性细胞所占的百分比降低,G0/G1期细胞占比增加,S期细胞比例降低;反之当过表达circBACH1时细胞吸光度升高,克隆能力增强,G0/G1期细胞占比降低,S期细胞比例增加。2.动物实验结果显示过表达circBACH1组裸鼠皮下肿瘤体积及瘤重增加,低表达circBACH1组裸鼠肿瘤的体积和瘤重降低。免疫组化的结果显示,过表达circBACH1实验组Ki-67表达增加,p27表达下调,而沉默circBACH1组Ki-67表达降低,p27表达升高。结论1.circBACH1可以增强肝细胞肝癌细胞G1期向S期的转化,加速细胞周期进展。2.circBACH1能够促进肝癌细胞增殖3.circBACH1能够加强肝癌细胞DNA的复制4.circBACH1能够提高肝癌细胞DNA的克隆形成能力5.动物实验中circBACH1可以促进肝细胞肝癌的增殖生长。第三部分:circBACH1在肝细胞肝癌中的分子作用机制目的深入探讨circBACH1在肝细胞肝癌中的作用通路,明确circBACH1对细胞周期及增殖活性调控的具体分子机制。方法1.分离并提取高表达和低表达circBACH1细胞株总蛋白,应用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测调控G0/G1向S期转化中关键的细胞周期蛋白(cyclinD1,cyclinE,CDK2,CDK4,P21 和 P27)的表达水平并用实时定量 PCR(qRT-PCR)对其RNA水平进行验证。2.在敲低circBACH1表达的同时敲低p27进行回复验证,并通过CCK-8实验、克隆形成实验以及流式细胞周期实验,观察肝癌细胞细胞增殖能力和细胞周期的变化情况。3.通过 circRNA-蛋白相互作用数据库(RBPDB,RBPmap 和 CircInteractome)分析,找出能够与circBACH1相互作用的RNA结合蛋白并取交集,然后通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP),磁珠法RNA Pull-down实验,凝胶迁移实验(EMSA)验证预测结果。4.过表达和敲低circBACH1表达后提取细胞总蛋白,利用蛋白质免疫印迹技术检测RNA结合蛋白(HuR)表达水平。然后过表达和沉默circBACH1,通过荧光双标技术和蛋白质核质分离技术检测circBACH1和HuR在细胞质和细胞核分布变化情况。5.为了验证circBACH1是通过HuR调节p27的表达,我们首先敲低HuR表达水平,分别检测p27蛋白质和RNA水平的变化情况。然后在过表达circBACH1的同时敲低HuR表达进行回复验证,用蛋白质免疫印迹实验检测p27蛋白水平的改变,通过CCK-8实验检测细胞增殖变化,通过流式细胞实验观察细胞周期变化。结果1.Western blot结果显示过表达circBACH1组细胞p27蛋白水平降低,低表达circBACH1组细胞p27蛋白水平增加。qRT-PCR结果显示两组RNA水平均变化不大。敲低circBACH1表达水平的同时抑制p27表达的回复实验结果显示,敲低circBACH1表达水平导致的细胞增殖活性降低,克隆能力下降,细胞周期阻滞等细胞表型被逆转。2.通过数据库预测分析发现RNA结合蛋白(HuR)能够与circBACH1相关作用,并且RNA结合蛋白免疫沉淀实验、磁珠法RNA Pull-down实验和凝胶迁移实验的结果也进一步证实了数据库的分析结果。3.过表达和敲低circBACH1水平后细胞总蛋白HuR的表达水平无明显变化。荧光双标和蛋白质核质分离实验结果提示过表达circBACH1时,HuR在细胞质的分布增加,在细胞核中分布减少;降低circBACH1表达水平使HuR在细胞质的分布减少,在细胞核中分布增加。4.蛋白质免疫印迹和qRT-PCR的实验结果显示敲低HuR表达水平后p27的RNA水平无明显变化,而蛋白质水平明显降低。此外敲低HuR表达能够逆转由过表达circBACH1引起的p27蛋白质水平降低和细胞表型变化(细胞增殖活性提高,克隆形成能力加强,细胞周期进程加快)。结论1.circBACH1通过抑制p27的翻译加速细胞周期由G0/G1期向S期转化,促进肝细胞肝癌的增殖。2.circBACH1能够与HuR直接结合,促进HuR由细胞核向细胞质转移,却不影响细胞内HuR总蛋白的表达水平。3.在肝细胞肝癌中circBACH1能够加强HuR对p27的翻译抑制作用,从而影响肝癌细胞增殖活性。